芽孢杆菌产甘露聚糖酶酶活稳定性的提高论文.doc

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1、目 录摘 要1ABSTRACT2第一章 绪论31.1-甘露聚糖酶的研究现状31.1.1-甘露聚糖酶的来源31.1.2-甘露聚糖酶的性质41.1.3-甘露聚糖酶的诱导41.2-甘露聚糖酶的纯化51.2.1 纯化的意义51.2.2 分离纯化工艺61.3-甘露聚糖酶的稳定性及稳定化71.4-甘露聚糖酶的应用81.4.1石油钻采81.4.2饲料添加剂81.4.3食品保健81.4.4造纸工业91.4.5纺织工业91.4.6工具酶91.5研究目的和研究内容91.5.1研究目的91.5.2研究内容10第二章 枯草芽孢杆菌-甘露聚糖酶的产生及性质102.1实验仪器与材料102.1.1实验仪器与设备102.1.

2、2试剂112.1.3菌种112.1.4培养基122.2实验方法122.2.1粗酶液的制备122.2.2酶活的测定122.2.3温度对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响142.2.4不同浓缩倍数对-甘露聚糖酶酶活稳定性影响142.2.5反复冻融对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响142.2.6激活剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响142.2.7防腐剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响152.2.8金属离子螯合剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响152.3实验结果与分析152.3.1温度对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响152.3.2不同浓缩倍数对-甘露聚糖酶酶活稳定性影响162.3.3反复冻融对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影

3、响172.3 反复冻融情况下酶的稳定性172.3.4保护剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响172.3.5防腐剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响182.3.6金属离子螯合剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响18结论18展望19参考文献20致谢22山东轻工业学院2012届本科生毕业论文 摘 要 一甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶，应用广泛，多采用微生物发酵制备。本文首先利用芽孢杆菌对发酵培养基进行培养，并通过分离纯化制得高纯酶进行运用。 对酶的稳定性进行研究，通过添加稳定化试剂，储存于不同的温度，将酶浓缩成不同的倍数，以及反复冻融来研究酶的稳定性。主要工作如下: 对芽孢杆菌发酵产生的酶液进行稳定性检测试验

4、，确定了芽孢杆菌产甘露聚糖酶的在各种不同的条件下酶活的稳定性情况;优化了酶液在储存过程中的可能遇到的各种情况，大大降低了运输和储存成本，有利于产品的后续精制以及使用。 一甘露聚糖酶粗酶液经盐析、超滤、离子交换层析、凝胶层析及超速离心即可制得纯酶液。 利用酶活随温度和反复冻融、不同浓缩倍数以及各种添加剂的变化而变化的规律，初步探讨了各种外界因素对酶活力的影响。 考察了七种添加剂(葡萄糖、海藻酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、明胶、EDTA、乙醇)在不同浓度下对制备的一甘露聚糖酶稳定性的影响，结果表明:添加葡萄糖可大幅提高酶的热稳定性，4时甘露聚糖酶的稳定性较高。确定了浓缩酶的稳定性，以及反复冻融对芽孢杆

5、菌产甘露聚糖酶的稳定性的影响。关键词：芽孢杆菌 甘露聚糖酶 浓缩 温度 反复冻融 添加剂 稳定性ABSTRACT -mannanase is an important hemicellulase, widely used, the use of microbial fermentation preparation. The first use of Bacillus culture fermentation medium, and separation and purification system, high purity enzyme use. To study the stability

6、 of the enzyme by adding stable reagent, stored at different temperatures, the enzyme is concentrated into a different multiples, as well as repeated freezing and thawing to study the stability of the enzyme. The main work is as follows: Enzyme produced by Bacillus stability testing to determine the

7、 stability of the situation Bacillus mannanase activity in a variety of conditions; to optimize the enzyme during storage may encountervarious situations, which greatly reduces the cost of transportation and storage, follow-up of refined products and the use of. -mannanase crude enzyme solution by s

8、alting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and ultracentrifugation can be obtained pure enzyme solution. Activity varies with the temperature and repeated freezing and thawing, different concentration factor, and a variety of additives changes the law, an

9、d discussed a variety of external factors on the enzyme activity. The seven additives (glucose, sodium alginate, potassium sorbate, sodium benzoate, gelatin, EDTA, ethanol) at different concentrations on the preparation of -mannanase stability, results show that: the addition of glucose significantl

10、yimprove the thermal stability of the enzyme, mannanase stability at 4 C higher. Determine the stability of the enzyme concentrate, and the repeated freezing and thawing of Bacillus mannanase stability.Key words：Bacillus; mannanase; enrichment; temperature; freezing and thawing ; additive; stability

11、21第一章 绪论 1.1-甘露聚糖酶的研究现状1.1.1-甘露聚糖酶的来源 -甘露聚糖酶在自然界中来源广泛，其中包括动物、植物、和微生物。在如翡翠贻贝(Perm viridis )1及亮大蜗牛2(Helix lucorum)甲壳纲动物圆口螺和爬行动物蛇等的低等软体动物的肠道分泌液中，在植物如芝麻、葛芭的种子、豆类植物(长角豆、瓜尔豆等)发芽的种子及天南星科植物魔芋萌发的球茎中，以及多数微生物中都能提取到-甘露聚糖酶。其中，微生物是-甘露聚糖酶的最重要来源，已报道的如细菌中的芽抱杆菌、假单胞菌和弧菌，真菌中的曲霉、青霉、核盘菌及多孔菌等都是产-甘露聚糖酶的常见类群。 甘露聚糖是广泛存在于植物多糖

12、中的一种半纤维素，很多微生物包括细菌、真菌和放线菌等都能分泌-甘露聚糖酶进行分解甘露聚糖作为自己的碳源或能源物质。如细菌中的芽袍杆菌3(Bacillus sp.)假单胞菌(Pseudomonas sp.) 、弧菌(Tlibrio sp.)单胞菌(Aeromonas sp.)等;放线菌中的链霉菌treptomyces sp.);酵母(Yeast);以及真菌中的曲霉(Aspergillus sp. )根霉(Rhizopus sp. )木霉(Trichoderma sp.)等均可分泌-甘露聚糖。值得一提的是，一些极端环境下的微生物，如嗜碱芽袍杆菌4(Calkalophilic Bacillus sp

13、.) 嗜热菌(Rhodothermus marinus),那不勒斯栖热胞菌5(Thermotoga neapolitana )及嗜热真菌6(Thermomyces lanuginosus)等也可产生-甘露聚糖酶，并且以其特有的酶学性质(如耐热性)拓宽了-甘露聚糖酶的应用领域。 真菌来源的-甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般pH值在4.05.5之间，最适反应温度一般在5575。如1990年Johnson KG7研究的里氏木霉，最适pH为5.5，最适反应温度为65;李江华等研究的黑曲霉，最适pH为5.5,最适反应温度为35。细菌和放线菌来源的最适pH却常为中性或者偏碱性，最适反应温度为4570。细菌中

14、，研究最多的是芽袍杆菌，除1991年马延和和田新玉报道了嗜碱芽袍杆菌产碱性-甘露聚糖酶外，最适反应pH值多为5.57.0。马建华等研究的枯草芽袍杆菌最佳反应pH值为6.4，最适反应温度为50。1995年，南开大学杨文博8等人从土样中分离筛选出一株产中性-甘露聚糖酶的地衣芽袍杆菌，经紫外线诱变处理后，获得一株酶活高产菌株(NK-27），并考察了不同碳源及培养条件对摇瓶发酵产酶的影响，得出地衣芽袍杆菌(NK-27)的-甘露聚糖酶为诱导酶，葡萄糖、半乳糖不利于产酶，魔芋粉、角豆胶为最佳碳源，有机氮源豆饼粉优于其它氮源，酵母膏对产酶有促进作用，通气量大对产酶有利等结论。 微生物来源的-甘露聚糖酶具有活

15、力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，己在实际生产和基础研究中得到广泛应用。1.1.2-甘露聚糖酶的性质 来源于动物的-甘露聚糖酶大多为多体酶，等电点偏酸。酶的分子量约为35kDa44kDa酶作用的最适pH偏酸，约为pH5.26.6，最适温度约为5055。 植物的-甘露聚糖酶主要存在于植物的储藏器官和种子中，与种子的萌发有密切关系。植物细胞产生的-甘露聚糖酶分子量大小约为35kDa45kDa，最适反应温度和耐性比细菌和真菌低，最适反应pH为4.55.5，略显酸性。这些特点是由植物生长环境和生理条件决定的。不同的植物、植物器官的不同时期产生的-甘露聚糖酶的性质和量都可能不同。 微生物来源的

16、-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、来源稳定、提取方便以及比动植物更广泛的作用pH,温度范围和底物专一性等显著特点，易被理论研究和工业化生产应用5。因此选育优良菌株是能否得到大量-甘露聚糖酶的关键。 大多数产-甘露聚糖酶的菌株可从土壤中筛选得到筛选产-甘露聚糖酶菌株的方法主要是基于其如下特性:-甘露聚糖酶是一种可诱导的细胞外泌酶，它可以分泌到菌体外的培养基中，作用于培养基中的底物，使底物降解产生单糖或二糖，常用的筛选方法有透明圈法，水解圈法和降解物着色法等。富集培养基需添加甘露聚糖物质，如槐豆胶、角豆胶、瓜尔胶及魔芋粉等，富集后可从培养基上生长的菌群中分离出有酶活的菌株。 目前己有部分研究筛选出高

17、产甘露聚糖酶的菌株，如杨幼惠等利用刚果红平板筛选法从芽抱杆菌属中筛选到产-甘露聚糖酶的理想菌株;罗强等利用离子注入和紫外线复合诱变方法筛选到了一株产-甘露聚糖酶的优良枯草芽抱杆菌9(Bacillus subtilis)M-66并采用系统全而反馈实验优化技术优化了发酵条件;蒙海林等以魔芋、番鬼芋、土壤和海水等从自然界采集到的样品为实验材料，经过摇瓶初筛和复筛，选出一株酶活力最高的菌株，再对该菌株进行钻诱变，经过分离、平板水解圈初筛和摇瓶复筛，得到一株优良变异菌，其酶活力是出发菌株的2倍。1.1.3-甘露聚糖酶的诱导 对于微生物所产生的甘露聚糖酶，除极少数的-甘露聚糖酶为组成酶外，大部分为诱导酶，

18、即:在培养基中添加适量的甘露聚糖类物质能极大地促进-甘露聚糖酶的生物成，否则只有基础水平的酶产生。研究还发现10，诱导物除-甘露聚糖酶的底物或底物类似物外，一些半纤维素类物质或苯酚类化合物也能有效地增加某些微生物-甘露聚糖酶的分泌水平。如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris )11在含有梭甲基纤维素、木聚糖的培养基中，-甘露聚糖酶的合成量几乎与以长角豆半乳甘露聚糖为诱导物时相同;在培养基中添加微量的黎芦酸、阿魏酸及香草酸，能有效地提高一株分解木质素的真菌(Phlebia radiates Frivo)12产-甘露聚糖酶。这可能是由多糖的水解一般需多种糖基水解酶参与，它们

19、的表达常常相互影响，因此不同结构的诱导物有时会产生类似的效果。 通过对酶性质的研究，可知这些酶的分子量小的只有22000，大的可到62000,相差十分悬殊;最适反应pH值真菌来源的一般偏弱酸性细菌和放线菌的常为中性或偏碱:绝大多数-甘露聚糖酶的等电点都在2.56.5之间，对重金属离子及琉基修饰剂比较敏感，有较好的热稳定性。有人对一株黑曲霉的-甘露聚糖酶做了分析测试，发现该酶经聚丙烯酞胺凝胶电泳显示基本为单一蛋白带，凝胶过滤法测的全酶相对分子量为49000, SDS-PAGE法测的全酶相对量为51000，等电点为3.8。此外，研究还表明:许多真菌及某些放线菌-甘露聚糖酶上都有不同程度的蛋白糖链，

20、在细菌及植物的-甘露聚糖酶中则很明显。 许多微生物产生的-甘露聚糖酶为多分子型13，即产生几种同工酶。这些分子型可能在分子量或等电点上有着微小的差别，但在水解甘露多糖时活力却明显不同，有着一定的互补关系。这说明微生物-甘露聚糖酶的诱导和分泌是一个有区别的忆谢调节过程。1.2-甘露聚糖酶的纯化1.2.1 纯化的意义 从微生物发酵液、动植物细胞培养液或酶反应液中分离纯化生物产品的过程通常称为生物技术下游加工过程(downstream processing )14，是生物技术的一要组成部分，也是决定一个生物技术成果能否转变为一个具有实用价值和具争力的产品的关键因素。其特点如下:发酵液或培养液通常是复

21、杂的多相资分散在其中的固形物具可压缩性，密度又与液体相近，固液分离困难。发酵液中所含目标产物的浓度较低(如抗生素约0.22% ,酶约0.52% ,胰岛素0.001%左右)，而且常存在与目标产物理化性质极其相似的异构体，因此提纯多步操作，总收率较低。生化物质在体外通常很不稳定，遇热、酸碱、有机溶剂会引起失活或分解，此外酶蛋白的活力还与其它蛋白酶、一些辅因子和金属离子的存在有关，这就加大了处理难度。生物培养通常为分批操作，要求下游加工具有一定的弹性。由于-甘露聚糖酶常和其它糖酶共存且自身往往含有多个组分，多个组分之间的理化性质非常相似，故酶的纯化有一定难度。多数微生物所产-甘露聚糖酶为胞外酶，成熟

22、发酵液离心去除菌体，首先用硫酸铵盐析收集含-甘露聚糖酶的蛋白质粗样品。进一步的纯化可采用离子交换、吸附层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析以及高效液相色谱等方式，可获得均一的酶蛋白纯品。目前已有许多来源的-甘露聚糖酶获得了纯化。国内田新玉15等首先报道了嗜碱芽袍杆菌(Bacillus sp.)N-16-5产生的二种胞外碱-甘露聚糖酶经硫酸铅沉淀、两次离子交换柱层折、经轻基磷灰石吸附柱层析及制备PAGE等步骤，得到了凝胶电泳均一的样品。1.2.2 分离纯化工艺 分离提纯工艺是生化产品开发者关注的焦点，如何设计一个高质量、高产量、低成本的提取工艺是对生化分离工程师的挑战，这不仅需要全面了解各种提纯技

23、术，有时还依赖十设计者的经验。 一般在工艺设计之前需明确产品的用途、纯度要求及商业价值。对工业用酶，要求成本低廉，如其它共存物不妨碍使用则无需花很大精力精制，将发酵液(或固体曲抽提液)除去菌体残渣浓缩后添加稳定剂和防腐剂制成液体酶，甚至将发酵液略加处理直接干燥即可;分析或临床诊断用酶则必须精制，微量其它酶的存在会严重干扰分析结果;供人体注射用酶要求更高，且必须不含热源和微生物毒素。对价格昂贵的产品(如酶、激素、抗体及基因工程产物)常用色谱分离法，但色谱法放大困难，成本较高，不适十低价格的产品分离。其次应尽可能弄清目标产物的性质，利用目标产物与杂质之间的差异选择处理手段。实际上，目标产物的性质往

24、往能被确定，但是大量杂质的特性却难以一一弄清，这使工艺设计带有一定的经验性与自目性。此外，还需建立一个方便灵敏的分析方法，对酶来说，通常是测定酶活及蛋白质含量。 在工艺设计过程中，通常可遵循下述原则:操作条件温和，尽可能保持目标产物的生物活性;选择最能有效利用目标产物与杂质性质不同分离提纯产物的方法;先用处理量大、造价低的手段，最后使用必需的造价高的分离技术;尽快采用高分辨率的方法;单兀操作之间最好能自然衔接，无需对物料进行调整处理;尽量减少处理步骤，提高产物收率;避免同时使用机理相同的分离方法。 此外，现代下游加工技术还有如下几个发展趋势: 1）多种分离纯化技术相互交叉、渗透和融合 如亲和技

25、术与其它操作相结合，取长补短，优势互补，派生出亲和沉淀亲和反胶团萃取、亲和膜过滤、亲和双水相分配等诸多高效分离技术。 2）发酵与分离相耦合 此技术已用十多种产品的生产中，优点是既可解除产物的反馈抑制，提高产率，又可同时提取产物，缩短生产周期，简化操作步骤等。 3）改进上游技术，简化下游加工过程 设法使胞内产物变为胞外产物，减少非目标产物的分泌(如色素、毒素、降解酶等)，赋十菌体或产物某种利十分离提纯的性质等。 4）完善与开发新的分离技术 径向色谱采用了径向流动技术，即样品和流动相从柱的圆周围流向圆心，流速比轴向流动可增加3-4倍，保持柱直径不变时只增加柱长，就可线性增大样品处理量，这就解决了传

26、统轴向色谱放大难的问题。再如，传统的色谱多孔介质孔内为扩散传质，传质阻力大是提高分离效率的重要制约因素，尤其是在高流速下。灌注色谱则以对流传质为特征传质快，高流速仍能获得高柱效。还有，电泳技术尽管可靠性与分辨率都可与高压液相色谱竞争，但是容量太小，一直用十分析。无载体连续流动电泳的出现则有望使电泳这一高效分离技术在工业化制备中发挥重要作用。1.3-甘露聚糖酶的稳定性及稳定化 酶的结构和功能是紧密联系在一起的，酶分子必须形成特定的二维结构(即天然折叠结构)，才能实现其特定的生命功能。酶能否形成并稳定在其天然折叠结构，决定于酶蛋白中各组分之间的相互作用。酶蛋白中的主链原子是通过化学键连接成长链的。

27、但是，化学键结合强度很大，一般的热扰动对它影响很小。因此，对酶蛋白的折叠结构起决定作用的主要是酶蛋白分子中各原子间的非键作用16：氢键、离子键、疏水相互作用、范德华力、二硫键。它们的键虽然弱，但它们相互作用的数量大，叠加在一起就成为维持和稳定蛋白质空间结构的不可忽视的作用力。在制备、分离纯化、储运及使用过程中，一些难以避免的因素如温度、pH、盐浓度变化以及搅拌等都有可能改变酶的高级结构，从而造成酶的失活。因此，增强-甘露聚糖酶的稳定性对提高产品收率具有重要意义。1.4-甘露聚糖酶的应用1.4.1石油钻采 -甘露聚糖酶可降解由瓜胶、改性瓜胶以及魔芋胶等制成的石油压裂液，提高压裂液的返排率，利于石

28、油钻采工业。 己有研究表明将-甘露聚糖酶应用于石油破胶技术取得相应成效17，如诺卡氏菌形放线菌产生的-甘露聚糖酶用于低温(3060)油井压裂液的生物破胶剂，具有效率高、成本低、对地层伤害小以及配胶工艺简便等优势，很好的解决了我国低温油井压裂液的破胶难题。另外，中科院微生物所、辽河油田井下公司和山东沂水酶制剂厂联合将-甘露聚糖酶制剂用于低温油井破胶，也取得了突破性进展。1.4.2饲料添加剂 甘露聚糖因其易在畜禽肠道内形成高粘度胶体从而影响营养物质的消化和吸收，因此被称为抗营养因子。-甘露聚糖酶能有效地分解饲料中的-甘露聚糖，去除饲料中的抗营养因子，促进动物生长18。不仅如此，在饲料中添加-甘露聚

29、糖酶还可提高饲料的消化率，可使豆粕的能值从10.08MJ/kg提高到11.76MJ/kg;降解产物甘露寡糖能改善肠道微生态环境，提高动物免疫功能。此外，饲料中添加-甘露聚糖酶还可降低畜禽粪便中有机物、氮和磷等的排放量，减少对环境的污染。因此，-甘露聚糖酶作为一种绿色饲料添加剂被广泛应用。1.4.3食品保健 -甘露聚糖酶为内切型酶，利用其该性质可从豆类植物种子中提炼植物油，降低咖啡、巧克力及可可液的粘性以利于进一步加工而不减损其风味19。除此，-甘露聚糖酶还可降解植物胶从而生产功能性低聚糖，其在食品的加工、贮藏和果汁澄清等方面的应用愈加广泛。 内切-甘露聚糖酶能水解含甘露聚糖的植物胶，产物为含有

30、不同糖分子(210个)组成的低聚糖，它是一种功能性寡糖20,21。甘露寡糖不仅可以被机体吸收，还能有效地降低人的胆固醇水平，减轻便秘，降低血糖，增加肠内双岐杆菌和乳酸菌的生长，从而增强人体的免疫力。国内外现己将其广泛用作食品添加剂，或直接用作保健食品食用。1.4.4造纸工业 -甘露聚糖酶是半纤维素酶，它与其它半纤维素酶协同作用，能有效地去除纸浆中的半纤维素，明显改善纸质。Francoise等报道22,23，-甘露聚糖酶可与木聚糖酶共同应用于造纸工业上的软木浆漂白工艺中，可得到比单纯用氯漂白和碱提取过程更好的纸浆特性。用-甘露聚糖酶替代氯和碱还可降低由它们带来的环境污染问题。1.4.5纺织工业

31、-甘露聚糖酶在纺织工业中用作天然纤维中半纤维素胶质降解24，并能有效地除去纺织印染产品上粘附的多余燃料以取代常规化学处理工艺，降低了能耗和对环境的污染。1.4.6工具酶 -甘露聚糖酶作为工具酶用于对天然多糖类物质糖链结构的分析。复杂糖类或糖蛋白的糖链中常有甘露糖昔键存在25,26，因此利用-甘露聚糖酶水解其中的甘露多糖类物质，并测定水解产物中多糖类物质的种类和比例，从而可推测其多糖结构。因此-甘露聚糖酶作为一种工具酶类，在糖工程、糖结构分析及植物基因工程等生物基础研究中有重要应用。1.5研究目的和研究内容1.5.1研究目的 近年来随着对自然界半纤维素资源的开发、饲粮中-甘露聚糖抗营养因子的消除

32、以及甘露低聚糖药用价值的发现，使人们对高产-甘露聚糖酶菌株的选育和发酵工艺、酶蛋白的特性、酶基因的克隆和表达均产生了兴趣。 我国对微生物-甘露聚糖酶的研究工作早期主要集中在生产菌种的筛选、诱变，酶的诱导、分离纯化及性质，酶水解底物方式，以及应用等方面，相关的论文已有多篇，其中研究最为详细的要数细菌中的芽抱杆菌27,28。进入90年代后，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，越来越多的工作集中在酶基因的克隆表达和活性位点的研究方面，但目前成熟的报道还不多。 本课题组筛选了一株高产的中性-甘露聚糖酶的甘露聚糖酶液体发酵菌株，并对其产酶的发酵工艺及纯化酶性质做了较深入的研究该酶具有在多变的环境

33、中活力高、稳定性好等特性，并具有一定的耐热稳定性，为实现-甘露聚糖酶的工业化生产和在饲料中的广泛应用打下了基础29,30。作为一种饲料用酶品种，有必要对其蛋白质结构与功能作进一步的研究。其研究成果，无论在理论上还是在实际应用上都将推动国内-甘露聚糖酶的研究进展。1.5.2研究内容 本文在前期研究的基础之上，拟解决如下问题: 1)不同温度条件下芽孢杆菌所产的甘露聚糖酶的稳定性。探索酶液的最佳储存温度。 2)将发酵液离心去除菌体，之后采用反复冻融测定在不断冻融的情况下酶液的酶活稳定性，为研究酶学性质打下了基础。 3)将芽孢杆菌产的甘露聚糖酶分装在透析袋中，撒上PGE将酶液浓缩至不同的倍数。研究浓缩

34、酶在储存工程中的最佳浓缩倍数以及稳定性。 4)利用DNS法，对-甘露聚糖酶稳定性进行分析。 5)将酶液与各种浓度的添加剂等体积混合，在此基础上研究哪种添加剂对甘露聚糖酶的稳定性起到最好的保护作用，便于储存运输，以提高终产品稳定性。 本文的研究思路是以-甘露聚糖酶的分离纯化与稳定性分析为研究重点:通过优化储存条件，进行对发酵液进行多级分离纯化以实现高纯酶的制备;采用DNS技术，对-甘露聚糖酶的稳定性进行分析预测以提高酶液在储存过程中的稳定性。 第二章 枯草芽孢杆菌-甘露聚糖酶的产生及性质2.1实验仪器与材料2.1.1实验仪器与设备 数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂 多功能电磁炉 广东

35、美的生活电器制造有限公司 恒温摇床 太仓市科教器材厂 电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 台式高速冷冻离心机 长沙维尔康湘鹰离心机有限公司 紫外可见分光光度计 龙尼柯仪器有限公司 洁净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂2.1.2试剂 魔芋粉 北京奥博星生物技术有限责任公司 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司 酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司 硫酸镁 天津市标准科技有限公司 氯化钾 天津市大茂化学试剂厂 磷酸氢二钾 天津市化学试剂三厂 硝酸钠 天津市大茂化学试剂厂 氯化钠 天津市广成化学试剂有限公司

36、刺槐豆胶（阿拉丁）国药集团化学试剂有限公司 3,5二硝基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠 天津市广成化学试剂有限公司 酒石酸钾钠 天津市广成化学试剂有限公司 苯酚 天津市风船化学试剂科技有限公司 无水亚硫酸氢钠 天津市红岩化学试剂厂 明胶 天津市广成化学试剂有限公司 无水乙醇 天津市广成化学试剂有限公司 葡萄糖 潍坊盛泰药业有限公司 聚乙二醇（6000） 天津市大茂化学试剂厂 海藻酸钠 永嘉精细化工二厂 D-甘露糖 国药集团化学试剂有限公司 苯甲酸钠 天津市广成化学试剂有限公司 山梨酸钾 天津市广成化学试剂有限公司 EDTA 国药集团化学试剂有限公司 移液器 上海狄式医疗器械有限公司

37、 2.1.3菌种 芽孢杆菌QYW-1(Bacillus sp.QYW-1)2.1.4培养基 (1）种子培养基/100ml及条件魔芋粉 1.0g； 酵母粉0.3g； 蛋白胨0.3g； 硝酸钠0.3g； 硫酸镁0.05g； 氯化钾0.5g； 磷酸氢二钾0.1g。pH为7.5, 180r/min，37恒温培养10h。 (2）基础产酶培养基/100ml及条件： 魔芋粉2.0g； 蛋白胨1.5g； 硝酸钠0.5g； 氯化钾0.6g； 硫酸镁0.5g； 氯化钠1.6g； 磷酸氢二钾0.26g。pH为7.5,180r/min，37恒温培养15h。2.2实验方法2.2.1粗酶液的制备 将摇瓶后的菌液倒入离心管

38、中，在5000r/min下离心15min，所得的上清液即为粗酶液。 2.2.2酶活的测定 本实验采用DNS法测定。酶活的定义：在37下，pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。 (1）DNS试剂的配置：称取10g3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶于水中，全部溶解后，加入20gNaOH、200g酒石酸钾钠，加入蒸馏水，使总体积至500mL左右，加热溶解后，加2g苯酚、0.5g无水亚硫酸氢钠，加热搅拌至全部溶解，冷却，用水稀释至1000mL，储于棕色瓶中。 (2）反应原理 利用糖的还原性质，将

39、3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，还原糖的量和棕红色物质颜色的深浅程度成一定的比例关系，可以用分光光度计进行测定。 (3）测定方法 标准曲线的绘制 取洁净具塞试管6支进行编号，分别按下表加入各试剂。表2-1试剂添加项目表（甘露糖:0.5g/L）管号单位012345含甘露糖量mg0.250.50.751.01.25标准甘露糖溶液mL0.51.01.52.02.5蒸馏水mL2.52.01.51.00.503,5-二硝基水杨酸mL0.50.50.50.50.50.5沸水浴7min，然后冷水冷却各加蒸馏水5mL540nm测吸光度值 将上述各管混

40、匀，然后在540nm波长下以0号管为对照，测定各管分光光度值。以甘露糖含量（mg）为横坐标，分光光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 还原糖含量的测定 将所得菌体生长液（10 12小时）6000r/min离心10min后得到的粗酶液，经适当稀释后，取0.1mL稀释粗酶液加入2.4ml已在45下预热的5g/L的刺槐豆胶中，在45准确反应20分钟后。加入0.5mLDNS试剂终止反应，煮沸7min显色，然后冷水冷却至室温，加5mL蒸馏水，同时以显色后加入已灭活的粗酶液做空白对照试验，540nm测定吸光值，根据标准曲线计算还原糖含量。计算公式： y(吸光值)=0.9093x(还原糖毫克数)-0.0316 公

41、式（2-1） 图2-1 DNS标准曲线 180.16mlmin 甘露聚糖酶酶活（U/ml）（%）还原糖毫克数样品稀释倍数1000100% 公式（2-3）注：180.16甘露糖的分子质量 ml粗酶液的ml数 min反应时间 （4）取2.4ml0.5%的魔芋胶溶液，45水浴预热5min，然后加入经适当稀释的粗酶液0.1ml，45准确反应20min，立即加入0.5mlDNS试剂，沸水浴显色7min，流水冷却后，测定540nm处吸光度值。空白对照先加DNS试剂后加粗酶液。2.2.3温度对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 将提纯后的酶液分装于多个小EP管中，测定初始酶活以后，分别储存在不同的温度下即4、20

42、、25、 30、每隔48小时取出测定酶活。2.2.4不同浓缩倍数对-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 将产的新鲜酶液测定初始酶活。并将酶液分装于四个相同的透析袋中，将PEG（6000）覆盖于透析袋上，浓缩至不同的倍数。并分别测定其浓缩以后的酶活。再一次将产的新鲜酶液测定初始酶活，并装于与上面个相同的透析袋中。同样将PEG（6000）覆盖其上，浓缩更大的倍数，马上测定其初始酶活，并将浓缩后的酶液储存于30的恒温箱中。每隔五天取出测定其酶活。2.2.5反复冻融对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 将产的新鲜酶液分装到不同的EP管中，并测定初始酶活，再将剩余的酶液放到零下20储存。一小时以后取出融化，并测定酶活。

43、再将剩余的酶液放到零下20储存。一小时以后再取出融化测定酶活。反复四次。2.2.6激活剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 将产的新鲜酶液测定初始酶活。并分别与0.5mol/L的葡萄糖，0.5g/L的明胶，质量分数是2%的海藻酸钠三种激活剂等体积混合。马上测定混合以后的初始酶活。并将混合后的酶液储存于30的恒温箱中。每隔五天取出测定其酶活。2.2.7防腐剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 将产的新鲜酶液测定初始酶活。并分别于体积分数是6%的乙醇，适量分数是0.05%的苯甲酸钠，浓度时1g/L的山梨酸钾三种防腐剂等体积混合，马上测定其初始酶活。并将混合后的酶液储存于30的恒温箱中。每隔五天取出测定其酶

44、活。2.2.8金属离子螯合剂对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 将产的新鲜酶液测定初始酶活。并与0.1mmol/L的EDTA等体积混合，马上测定其初始酶活。并将混合后的酶液储存于30的恒温箱中。每隔五天取出测定其酶活。2.3实验结果与分析2.3.1温度对-甘露聚糖酶酶活稳定性的影响 表 2-2 不用温度下甘露聚糖酶的酶活力酶活力U/ML4202530初始酶活力（稀释81倍）111.89111.89111.89111.8948小时后（稀释61倍）108.64100.45100.1299.9696小时后（稀释51倍）105.1295.1896.4994.35144小时后（稀释51倍）103.2386.

45、5284.8182.36192小时后（稀释41倍）100.8975.4265.0272.40 芽孢杆菌是一种能合成-甘露聚糖酶的菌种。从温度对酶活的影响实验中得出：4时，甘露聚糖酶的酶活稳定性较高，酶活随时间减少的较少。而20，,25,30时，甘露聚糖酶的酶活随时间的变化较大，酶活损失严重。从而比较出4是最适的储存甘露聚糖酶的温度。2.3.2不同浓缩倍数对-甘露聚糖酶酶活稳定性影响 图 2-2 不同浓缩树下甘露聚糖酶的酶活稳定性 从图2-2可以看出，发酵粗酶液经高速离心后，分装于透析袋中，将PEG覆盖其上进行浓缩，随着浓缩倍数的增加酶活也不断的增加。且浓缩倍数越大，酶活增加越明显。 表2-3 浓缩酶的酶活力初始酶活（