硕士论文--人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究（可编辑） .doc

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1、 北京协和医学院中国医学科学院硕士学位论文人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究姓名:李铎申请学位级别:硕士专业:免疫学指导教师:张宇光201105北京协和医学院硕士学位论文中文摘要间充质干细胞来源于胚胎早期发育中胚层,是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,在体外可以分化诱导为骨、脂肪、神经等多种组织细胞。具有向受损组织归巢并且修复、重建受损或病变的组织器官的特点,此外应用间充质干细胞做为细胞治疗的手段时由于其具备低免疫原性的特点,可降低免疫排斥反应,提高移植成活率,使其成为当前成体干细胞研究的热点。人脐带结缔组织是间充质干细胞的丰富来源,相对于骨髓来源的间充质干细胞破坏侵入性分离过

2、程而言,脐带间充质干细胞更加易于获得,并对母子均无损伤,使其成为细胞治疗中的理想细胞而逐渐替代骨髓来源间充质干细胞。因此如何快速,高效地从脐带中分离、储存间充质干细胞而满足基础与临床研究的需要成为尤为重要的问题。本研究工作主要包括两部分内容。第一部分是应用组织块贴壁法分离、培养人脐带间充质干细胞,观察采集脐带后不同处理时间、以及脐带冻存复苏后脐带间充质干细胞分离成功率、生长增殖情况等,探讨组织块贴壁分离法用于间充质干细胞大规模生产扩增的可行性。实验采用培养基对?大小的人脐带组织块进行贴壁培养,观察不同处理时段的脐带组织原代细胞获得时间、细胞得率等情况。结果表明,小时以内处理的组织细胞分离成功率

3、%/,得到原代细胞的平均时间.天,平均得到.个细胞/;?小时组的分离成功率为%/,得到原代细胞的平均时间为为.天,平均可获得.个细胞/;?小时组的分离成功率降至%/,平均获得原代细胞的时间为.天,平均获得.个细胞/。液氮储存复苏组分离成功率为%/,得到原代细胞的平均时间为.天,平均可获得.个细胞/。结果表明,随着脐带组织处理时间延长,分离成功率下降,平均每厘米脐带组织获得原代细胞数量降低,脐带组织块冻存复苏后可以获得人脐带间一充质干细胞。第二部分是探讨表皮生长因子和成纤维样生长因子能否促进原代间充质干细胞的贴壁能力,以及对传代细胞免疫表型、细胞周期及诱导分化能力的影响。实验应用胶原酶消化法对人

4、脐带间充质干细胞进行分离,观察和对原代细胞贴壁生长增殖情况、以及对第代细胞免疫北京协和医学院硕士学位论文表型、细胞周期及诱导分化能力的影响。结果表明,完全培养基组促贴壁时间平均为.小时,组为.小时,组为.小时,组为.小时。培养至第天时,组、组、组细胞数量分别为细胞培养组的倍、倍和.倍,均有统计学意义。传至第代时各组细胞的?类分子、间充质干细胞表面常见分子、均表达为阳性;而?类分子及造血干细胞表面分子、白细胞表面共同抗原均表达为阴性。细胞周期分析显示:细胞培养基组期细胞为.%,组、组组期细胞比例分别为.%、.%、.%,略高于细胞培养基组。组、组、组均可以成功向成骨和成脂方向诱导。综上所述,组织块

5、贴壁分离法可以获得原代贴壁的间充质干细胞,但处理时间对组织块贴壁分离法的成功率有影响。生长因子、可促进人脐带间充质干细胞早期贴壁和细胞增殖,但是否促分化还有待进一步研究。关键词:脐带、间充质干细胞、组织块贴壁分离法、北京协和医学院硕士学位论文 舶 .,雒. 伍 班 胁玛., 陀 孙 够 啪醐 岫够 托锄 部 仕 够,金.、耽 .玛 、矶把./ 、析 %., 狙 .士. /血,. .士./ 行 锄、析 ;.士.士. .士.嘶 ;.士.珥 . . 慨 .士. /砬.士.鲫、, .仃巧., 也 觚. :咖 .撇.,.,.,.彘 锕 脏 . 蛳 世.?, , ,帅 疵 鲥. , .北京协和医学院硕士学

6、位论文也 . , 肌仃 .仃 铆驴, .锄 眦.: 啪, ,北京协和医学院硕士学位论文前言干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,可在体外培养扩增、定向诱导分化为多种细胞系。根据个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞存在于骨髓、血液、皮肤、消化道内皮组织等组织中,对成体干细胞及其可塑性研究是近二十年来生物医学领域中热点之一,特别是干细胞能参与损伤修复矗。,神经再生和抗衰老等研究更是使再生医学进入了一个崭新领域。间充质干细胞 ,通常是指来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,并能在特定条件下分化为软骨细胞、成骨细胞、肌

7、肉细胞、脂肪细胞等。在成体干细胞中,间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中,特别是骨髓、脂肪组织、脐血,甚至外周血也发现有间充质干细胞。由于间充质干细胞具有强大的增殖能力、较强的多向分化潜能曲、以及其低免疫原性一。和免疫调节功能,成为组织工程中的理想种子细胞憎。,因而在细胞替代治疗和组织工程方面显示出巨大价值而备受关注。胚胎形成过程中,滋养层细胞形成胎膜、脐带、胎盘。脐带是连于胎儿脐部与胎盘间的条索状结构,内含来自中胚层的胶样结蒂组织,结构上含有一条静脉和两条动脉,三条血管一端与胎盘相续,另一端与胎儿血管连接,血管周围富含丰富的胶原结缔组织 。间充质干细胞随着胎儿的成熟及其血液循环,大部分定位在

8、脐静脉内皮下层和胎盘。因此,人脐带结缔组织含有丰富的间充质干细胞。等将 从脐血管周围剥除,消化后培养可见成纤维样细胞;等副单独消化脐血管后,获得血管内皮与内皮下混合细胞体,培养后可见成纤维样细胞,由此可以判断,脐带间充质干细胞主要来源于 和脐血管。由于脐带是胎儿分娩后的废弃物,避免了敏感的伦理问题;加之其来源广泛,取材方便,可以无创伤获取,不会给捐献者带来痛苦和感染;脐带组织富含间充质干细胞,体外分离、传代培养较容易,多次传代后,仍具有稳定核型;因而成为一种新的来源,具有良好的应用前景。大量研究表明由人脐带分离所得的贴壁后成长梭形,与成纤维细胞形态相似。人脐带细胞表面阳性表达、.类分子等”,而

9、、等造血干细胞表面标记及?类分子表达阴性。“。目前,文献报道人脐带问充质干细胞分离方法主要有酶消化分离法和组织块贴壁法,酶消化分离法主要应用胶原酶和胰蛋白酶对脐带组织细胞外基北京协和医学院硕士学位论文质成份中的透明质酸和硫酸氨基葡聚糖类似于蛋白多糖构成的胶原纤维网进行消化水解从而获得目的细胞。胶原酶是一种从微生物的发酵液中提取出来的酶,对细胞间质有较好的消化作用,尤其对胶原纤维成分作用比较突出;胰蛋白酶是广泛应用的消化剂,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,水解细胞间质中的蛋白质使细胞从组织中离散。近年来,酶消化法多采用胶原酶与胰蛋白酶并用,或添加透明质酸酶、梭菌酶等联合消化,增加其对脐带组

10、织的分离作用,以期获得更多的间充质干细胞。驯、圳等研究单独采用胶原酶、胶原酶消化脐带组织,而袁源九、四等应用透明质酸酶、胰酶及胶原酶等酶复合物消化脐带组织,但从文献报道中来看,由胶原酶法分离所得细胞大多维持在个细胞/,并且所获得的是细胞混杂群体,不是单纯的。组织块贴壁法是将脐带切割为细小组织块直接贴附于培养基上,利用间充质干细胞具有迁移能力这一重要特性而获得直接贴壁的。比副等将脐带分为.大小组织块贴于含%、几谷氨酰胺及非必须氨基酸的低糖培养基中,天获得贴壁的人脐带间充质干细胞。徐燕比驯等将?甜组织块贴附于含有血小板衍生生长因子等多种因子的/培养基中,天可获得原代,并且细胞数量高达.。个细胞/。

11、眦瞄创等人将.一大小的组织块培养至含%的培养基中获得人脐带间充质干细胞。由于组织块法对脐带间充质干细胞损伤小,可以直接获得形态较为均一的问充质干细胞,能很好地保持细胞活力,且细胞得率达。个细胞/,应该对于大规模生产更为有利。如何短时间获取大量功能状态良好的脐带间充质干细胞,维持的原始状态,及控制分化方向是当前研究的热点。表皮生长因子和成纤维样生长因子均是体内的一种活性物质,籍由刺激生长因子受体的磷酸化,完成信号转导,从而发挥作用,促进细胞生长瞄副心训等人在对人脐血间充质干细胞的研究中添加了和等因子后,明显促进无血清培养中的细胞增殖,徐燕刮等在/培养体系中添加、及血小板衍生因子等多种因子后,能明

12、显提高脐带间充质干细胞数量。还有研究表明,选用早期贴壁细胞进行培养,有利于间充质干细胞的生长增殖。本实验在现有酶消化法大规模分离培养人脐带间充质干细胞生产工艺基础上,探讨在培养体系中添加细胞因子,是否能促进原代的早期贴壁,促进间充质干细胞生长,并维持其干性;另一方面考证组织块贴壁法用于日后人脐带间充质干细胞生产的可行性,特别是与脐带新鲜程度的关系,以期为人脐带间充质干细胞的产业化大规模生产提供思路。北京协和医学院硕士学位论文实验材料.材料.主要试剂名称 来源佰:粉末 美国公司低糖培养基干粉 美国公司美国公司胰蛋白酶干粉 美国公司美国公司胰岛素冻干粉 美国公司干粉 美国公司地塞米松干粉 美国公司

13、吲哚美辛溶液纯度% 天津一方科技有限公司冻干粉 美国公司冻干粉 美国公司胶原酶 美国公司茜素红 上海研生生物试剂有限公司油红上海恒远生物试剂有限公司台盼蓝染液 上海易利生物有限公司.%溶液 广州威佳科技有限公司无水乙醇及 天津英博生物化学试剂公司“ 美国叻公司鼠抗人一 美国 公司鼠抗人一 美国 公司鼠抗人? 美国公司鼠抗人?美国公司鼠抗人一 美国 公司鼠抗人一 美国 公司鼠抗人同型对照 美国 公司北京协和医学院硕士学位论文.主要耗材名称 来源与产地细胞培养瓶 美国公司培养板 美国 公司手术刀片 上海浦东金环医疗用品有限公司手术刀片 上海浦东金环医疗用品有限公司手术刀片 上海浦东金环医疗用品有限

14、公司一次性移液管 美国公司.主要仪器及设备仪器 来源及产地普通冰箱 德国一冰箱 美国微量加样器德国美国细胞培养箱.振荡混匀器 美国恒温水浴 上海方瑞仪器厂苏州珀西瓦尔有限公司大容量冷冻恒温振荡器美国超纯水器日本倒置显微镜高速离心机 美国美国?流式细胞仪北京昌平长城空气净化设备工程公司超净台细胞计数板 上海安信光学仪器制造有限公司上海比朗仪器有限公司磁力搅拌器台式仪 广州深华仪器设备有限公司台式高速离心机 美国,美国一涡旋混合器移液器 德国北京协和医学院硕士学位论文.主要试剂的配制. :. . . .电子天枰分别称取 、。、 、:,溶解于超纯水中,至完全溶解,调至.,定容至保存备用。高压蒸汽灭菌

15、至少分钟。.【液:电子天枰分别称取.、 .,、?.、.、摄 .溶于超纯水中,至完全溶解,调节值至.,定容至,高压灭菌至少分钟,保存备用。./培养基:将一袋/培养基干粉.全部倒入大烧杯中,用少量超纯水将袋内残留培养基洗净,加入超纯水水温。一。,磁力搅拌器搅拌溶解,加入. 后微搅拌溶解,加超纯水定容至。用/溶液或/溶液调至.。用.岬滤膜正压过滤除菌,溶液在一下避光保存。.%胶原酶溶液:?【和称取型胶原酶.于离心管中,加入双抗混合好的溶液,使胶原酶充分溶解。印离心,秒,将溶液轻轻转入到含.的.【和双抗混合溶液中。反复洗涤离心管以保证完全转移,注意低温操作,避免操作过程中产生气泡。. 孔径滤膜过滤除菌

16、,分装于.保存备用。.%胰酶.溶液:电子天枰称取.胰酶至烧杯中,加入液于低温水浴中溶解胰酶粉末,玻璃棒搅拌研磨。将充分溶解的胰酶溶液转移至含有“的容量瓶中,定容至。转移过程中避免产生气泡,否则损失酶的活性。用. 的滤膜过滤,分装入灭菌的离心管中。.。保存。不可反复冻存,每次解冻后。保存,并在短期内用完。.%茜素红染液:称取.茜素红粉加 溶解后,调节值到.,静置后过滤,北京协和医学院硕士学位论文常温条件下储存。.%油红染液:称取油红粉.于烧杯中,先加少量丙二醇,水浴,玻璃搅棒搅拌研磨,边搅拌边加入剩余的“丙二醇。水浴加热到.。,使之充分溶解。将溶解后的溶液用液滤纸过滤,封口,。长期储存。.低糖的

17、配制:取一袋低糖干粉.,放入容器中,并用超纯水充分清洗包装袋内面次,加入少量的超纯水使其溶解,定容至,磁力搅拌器搅拌混匀。必要时用/的和/调节值。用. 滤膜过滤除菌,分装于无菌血清瓶中,。冰箱保存。配好的培养基使用前加入/青霉素和/的链霉素。./胰岛素溶液配制:称取胰岛素冻干粉溶于“溶液.,浓度咖。过滤后分为份,每份.含.胰岛素,分装在管里,.。保存。.砌/非水溶性地塞米松溶液的配制:称取.地塞米松分子量.溶于无水乙醇,浓度为儿。过滤后分装在管里,.。保存。.溶液配制:/称取.冻干粉溶于.生理盐水。.溶液配制:/称取.冻干粉溶于.生理盐水。. .姗/溶液的配制:,溶于中,浓度为.儿,过滤后分为

18、分将装在管里,.。保存。.咖/抗坏血酸钠水溶液的配制:北京协和医学院硕士学位论文称取.抗坏血酸钠粉末溶于超纯水中,终浓度为./,过滤,灭菌备用。./吲哚美辛溶液配制:取吲哚美辛溶于甲醇溶液。.成脂诱导启动培养基:取 的溶液、 的地塞米松溶液、. 终浓度为的胰岛素溶液、吲哚美辛溶液 、.叫/培养基混匀,总体积 。.成脂诱导维持培养基:将配制好的低糖培养基内加入. 胰岛素溶液,混匀,总体积。培养基一般现用现配,防止胰岛素长期储存后降解,影响培养基诱导效果。.成骨诱导培养基:吸取.低糖溶液,加入胎牛血清、 一甘油磷酸钠装、 .衄/的抗坏血酸钠水溶液, 终浓度为胰岛,总体积 。颠装、并加入双抗各素溶液

19、、/倒混匀,。储存备用。现用现配,防止因子长期储存后降解,影响培养基诱导效果。北京协和医学院硕士学位论文一组织块贴壁法分离人脐带问充质干细胞的研究组织块贴壁法是将脐带切割为细小组织块直接贴附于培养基上,利用间充质干细胞具有迁移能力这一重要特性而获得直接贴壁的,这种方法对细胞损伤小,可以直接获得形态较为均一的间充质干细胞。本部分实验主要考证组织块贴壁法应用于人脐带间充质干细胞产业化的可行性。实验方法.人脐带间充质干细胞组织块贴壁分离培养.实验分组为了进一步观察脐带采集后不同处理时间及储存条件对组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞的影响,实验分为时内处理、?时处理、?时处理和液氮冻存复苏后四组。

20、观察原代细胞获得时间、细胞形态。.人脐带组织处理使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中取出,放入第一个烧杯中浸泡清洗。由镊子取出脐带放入其中一个大号培养皿中,并使用手术刀切除双侧手术线结扎及淤血部分。用含双抗对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗,一般冲洗两遍,去除血污。将清洗干净的脐带置于另一个大号培养皿中,均分为?部分,平均每部分约长?。对每一小部分沿纵向进行分离,使脐带组织管状变为片状。将片状脐带组织进行进一步的分离,切割为?甜大小的组织块。使用吸管将组织块逐一种植入预先用含%胎牛血清的/培养基包被好的培养瓶内,密度一块/瓶为宜。正向置于。,体积分数为%饱和温度湿度温箱内。每小时补加培养基,

21、小时后全量换液。每周换液两次。.人脐带组织块冻存将组织切割分离至?姗小块后,使用吸管逐一吸入含冻存液的冻存管中,将冻存管放入程序降温盒中,。冷藏分钟,转入一。冰箱放置小时,后再入一。冰箱过夜,次日液氮保存。进行液氮冻存的脐带组织均为采集后小时内处理。北京协和医学院硕士学位论文.人脐带组织块复苏平均冻存三周左右后进行复苏。取出冻存管,迅速放入盛有。温水的烧杯中,使其快速溶化。将溶化的组织块倒入离心管中,用吸管吸取冻存液。用 反复吹打清洗组织块。离心,/,分钟。弃去上清液,用吸管将组织块逐一贴于预先包被的培养瓶中,一块/瓶为宜。培养方法同.脐带不同处理时间对间充质干细胞原代细胞的影响各组组织块贴壁

22、法得到细胞后,去贴块,用.%胰酶.消化,用%的培养基中和,制成细胞悬液,进行台盼蓝染色计数。采用血球计数板计数,计算公式如下:细胞浓度细胞数/毫升原液个大格细胞总数/稀释倍数细胞总数细胞浓度原液毫升数.人脐带间充质干细胞的传代培养将时内处理组的细胞传代培养,进行后续实验。用含%胎牛血清的/培养基重悬细胞,铺入或瓶中。根据细胞生长情况以后每?天传代一次。传代时向细胞培养瓶中加入胰酶若是细胞培养瓶则加,胰酶消化后迅速加入加入的细胞培养基,反复吹打以使细胞脱落下来,将细胞悬液转入离心管中,/,离心分钟收集细胞。弃上清后,以一定体积的新鲜培养基重悬细胞,并将细胞悬液转移到新的培养瓶中,置于,%培养箱中

23、培养。.人脐带间充质干细胞生长曲线分析细胞传代之后,经过短暂的悬浮然后贴壁,随后度过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后,停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化,典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,斜率较大的对数生长期、呈平台状的平顶期及退化衰亡个部分。取时内处理组的第.代生长良好的细胞,分别用.%胰酶.消化,%的培养基中和,制成细胞悬液。以细胞数./孔铺种至孔板,每组设置三个复孔。每隔小时用.%胰酶一进行消化,收集细胞,利用血球计数板进行台盼蓝染色计数,连续天。以存活细胞数对培养时间作图,绘制生长曲线。并按公式计算对数生长

24、期的倍增北京协和医学院硕士学位论文时间:/。:倍增时间,:细胞数由至的时间;:细胞数。.人脐带间充质干细胞细胞周期测定正常哺乳动物细胞为二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不同的含量。在细胞周期的各个时期、中含量随各时相呈现出周期性变化,在期细胞开始合成和蛋白质,但含量仍保持二倍体,进入期后开始合成,此时细胞核内的含量介于和期之间。当复制成倍体时细胞进入期并继续合成和蛋白质,直到进入期,因此单纯从含量无法区分期和期,一旦有丝分裂分裂成个细胞,同样和期的含量也无法区分。荧光染料与结合,其结合量与含量成正比。因此,通过流式细胞术染色法对细胞内含量进行检测时将细胞周期各时相区分为/期,期和/期。/期具有

25、二倍体细胞的含量,而/期具有四倍体细胞的含量,而期的含量介于二倍体和四倍体之间。对时内处理组脐带间充质细胞,应用试剂盒进行细胞周期测定。.将培养至第四代的细胞消化后,用冷洗细胞两次,印删,离心若细胞数过少可提高转速到,为减少细胞损失可用.离心管离心;航 .弃上清留大约下面的液体防止碰到细胞团,加入并低速混匀细胞;.室温离心,/分钟,离心分钟;.重复步骤.、.各一次;仃.弃上清留大约下面的液体,加入 重悬细胞;.计数细胞,用硼 将细胞密度调为个/“;.染色:.取.“含细胞个;。.每管加入 ,用手轻拍混匀:.室温反应,保留 ;.加入 ,轻轻混匀:.室温反应,保留 和 ;.加入冷,轻轻混匀,黑暗处.

26、孵育;.用尼龙网过滤细胞,加入上样管上流式分析内分析完。北京协和医学院硕士学位论文.人脐带间充质干细胞免疫表型测定对时内处理组的第代细胞进行免疫表型分析。.调整每管细胞浓度为,分装在个检测管中;.每管添加抗体及同型对照各 ,。避光,孵育分钟;.洗涤后用/的多聚甲醛固定分钟;.流式细胞仪检测.利用校准标准样品调整仪器,在使激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上,前向角和测向角的荧光强度最强,并且变异系数最小;.检查鞘液,废液筒水量;.开启软件、编辑实验文件;.分别将加好样的检测管依次上样,并不断调整流速、测量细胞数、测量参数;.收集实验数据;.样品测量完毕后,进行管路清洗并关机;.

27、数据分析。.人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化及鉴定对时内处理第代的细胞进行诱导分化实验。.人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化.用含%胎牛血清的/培养基配制细胞悬液,细胞数 /孔铺入六孔板中的四孔,其中两孔为阴性对照,另两孔为诱导组;.待铺种的细胞融合至%左右,诱导组更换成脂诱导启动培养基培养三天,后更换为维持培养基,交替换液,诱导两周。阴性对照组继续使用%胎牛血清的/培养基。.人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化的鉴定.弃去诱导液,用溶液清洗六孔板三遍;.%多聚甲醛固定分钟;.弃去固定液,加入.%油红染液,染色分钟;.吸去染色剂,再用充分清洗两遍,洗净染液;.加入苏木素复染分钟;.吸去苏木素,

28、充分清洗去掉多余的苏木素,镜下观察。北京协和医学院硕士学位论文.人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化及鉴定对时内处理第代的细胞进行诱导分化实验。.人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化.用含%胎牛血清的/培养基配制细胞悬液,细胞数/孔,铺入六孔板中的四孔,其中两孔为阴性对照,另两孔为诱导组;.待铺种的细胞融合至%左右,诱导组更换成骨诱导培养基,阴性对照组继续使用%胎牛血清的/培养基;.细胞诱导培养两周。每周换液两次。.人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化的鉴定.弃去诱导液,溶液清洗六孔板三遍;.%多聚甲醛固定分钟;.吸去固定液,加入%茜素红染液,分钟;.吸去染色剂,再用充分清洗两遍,洗净染液;.加入苏

29、木素复染分钟.吸去苏木素,充分清洗去掉多余的苏木素,镜下观察。.统计学处理统计学软件进行数据分析,应用统本实验采用 进行图表绘制。计量资料以均数标准差曼表计表和印 示。组间均数比较采用独立样本检验,以.为差异有统计学意义。北京协和医学院硕士学位论文实验结果.人脐带间充质干细胞的形态学观察.人脐带组织块贴壁培养组织块切割成?舢小块,植入培养瓶中,密度?块/瓶。如图。. .人脐带间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下观察,每组均可见细胞由组织块周围贴壁生长,细胞形态为长而扁平的梭形,呈现典型的成纤维细胞形态图、,去掉组织块后培养,细胞呈极性排列,集落成旋涡状图、。形态比较均一,排列较为整齐。北京协和

30、医学院硕士学位论文.陀.呦蝴 喇甜嚣蛆柚锄讹恤曩伽.? 跚 .? .伽 钾叫 .脐带不同处理时间对间充质干细胞原代细胞数量的影响对不同组别获得的原代细胞进行显微镜下观察发现时内处理组天可以获得原代细胞,平均获得原代细胞的时间为.天,平均每厘米脐带可得到.个细胞;?小时处理组最早天得到原代细胞,平均获得原代细胞的时间为.天,平均可获得.个细胞/:?小时处理组天可获得原代细胞,平均获得原代细胞的周期为.天,平均可获得.个细胞/。脐带?小时处理组、?小时处理组与小时内处理组在得到原代细胞数量有统计学差异.。液氮冻存组天可以获得原代细胞,平均获得原代细胞的时间为.天。平均可获得.个细胞/。获得原代细胞

31、数量与非冷冻小时处理组相比,无明显统计学差异。见表。北京协和医学院硕士学位论文.实验分组 标本数培养成功标本数 原代细胞平均获得时间天平均原代细胞数/时内.?时. .?时. .液氮储存. . ,/疗 .宰.人脐带间充质干细胞的生长曲线小时处理组,传至?代时,细胞生长增殖数量分别为见表:.细胞代数细胞平均数. . . . .士. . . . . .傩 . . . . . .细胞生长曲线如图。细胞接种后的第天为潜伏期,从第天起开始进入对数生长期,?天到达高峰期,此后左右逐渐进入平台期。根据生长曲线得出人脐带间充质干细胞的平均群体倍增时间为.小时。文复夏苔餐露蒜搴瓴侠毫如.北京协和医学院硕士学位论文

32、.人脐带间充质干细胞的细胞周期分析对时内处理组的第代细胞进行细胞周期分析图发现:/期细胞占总体的.%/期占.%,位于横坐标的.期占.%/为.期为四倍体细胞,期为二倍体细胞,比值为细胞碎片为.%,细胞聚集体为.%哺甜:啦.腩:卜:响啪 : 脯粥:.辱:.% .:.% .:.菘,:.%:.靼: .%.:.男:.努细蛳:.%翻:嘴:卵:. .人脐带间充质干细胞的细胞免疫表型鉴定对时内处理组的第四代细胞进行细胞免疫表型鉴定结果为:?:.%,?:.%,: .%,:.%,:.%、:.%。?类分子、间充质干细胞表面常见分子、表达为阳性;而?类分子及造血干细胞表面分子表达为阴性、白细胞表面共同抗原弱表达。见图

33、。北京协和医学院硕士学位论文澈椭鲈高凇轰;霉毒。璎勃醇菇畦曩鞠群铬髓树一一柚柚 蝣耪 辑瑚蘸 露 .镑嵫 辑越嗽糖秘蝴韩挣醐 麓”搬一麓劓睡辩焉岱群钿矗鬣秘一螂时辫越%蝴 ,嘲 嚣纛磁 越麓心花麓. 北京协和医学院硕士学位论文.人脐带间充质干细胞体外诱导向成脂分化能力对小时内处理组的第四代细胞进行成脂诱导分化发现,诱导一周左右,细胞形态发生变化,由长梭形变为短梭形,且呈现细胞聚集现象,镜下可见成小片方形状的细胞聚集团。两周左右可见胞质内折光性强的脂滴。对其进行油红染色,可见被染红的脂滴,阴性对照组未见任何明显改变见图。. .? 孕 垂.人脐带间充质干细胞体外诱导向成骨分化能力对小时内处理组的第

34、四代细胞进行成骨诱导分化发现,诱导一周左右时可见细胞形态发生细微变化,形状较原先而言变的不规则,高倍镜下可见胞质内含有黑色细小颗粒,且细胞外基质成分增多。二周后可见细胞形成类似结节状结构,经茜素红染色后可见细胞聚集处有深色沉着物,中间颜色深,并向四周放射,阴性对照组中未见明显改变。见图黻 .妣舀 . 仃伊北京协和医学院硕士学位论文讨论目前已有相当数量的研究小组从人源脐带分离出间充质干细胞,主要来源于自脐带的及脐静脉皮下层“驯,其主要分离方法是酶消化法和组织块法。组织块法由贴壁的组织直接获得,相对酶消化法的化学反应过程而言对细胞伤害较小。瞄等研究表明过多消化组织会降低细胞的生存能力,消化过程中可

35、能会水解细胞表面受体,从而改变细胞的功能。此外,这种方式可以提高脐带组织的利用率,浪费较小;省去酶消化法的复杂的操作步骤,并节约成本。因此有很多研究小组选择使用组织块贴壁法进行人脐带间充质干细胞的分离,其中不乏有获得较高细胞得率的小组。考虑到细胞产业化需要这种低成本、高效的方式,于是本实验对组织块贴壁法分离人脐带间充质干细胞产业化的可行性进行了研究。实验中选用含有%的培养基进行组织块分离培养,成分相对简单,避免由于增加其他额外成分而造成细胞促分化的可能。有利于日后细胞产品的开发应用。由于脐带问充质干细胞产业化后脐带采集后处理时间不一,本实验观察脐带采集后不同处理时间及将采集脐带液氮冷冻处理后对

36、脐带间充质干细胞的影响。以期对脐带组织块贴壁分离培养方法在产业化中应用进行探讨。实验结果可见,小时内处理组培养天后镜下可见细胞贴壁生长,平均获得原代细胞的时间为.天,平均可得到.个细胞/;?小时处理组天后镜下可见原代细胞生长,平均获得原代细胞的时间为.天,平均可获得.个细胞/;?小时处理组天可获得原代细胞,平均获得原代细胞的时间为.天,平均可获得.个细胞/;液氮冻存组冷冻后复苏的组织可以获得人脐带间充质干细胞,且形态与非冷冻组得到的细胞形态相似,天可以获得原代贴壁细胞,平均可以获得.个细胞/。其中小时内处理组的标本全部可以得到贴壁的,而?小时处理组和?小时处理组分离成功率分别约为%和%。实验表

37、明处理时间对组织块贴壁分离法的成功率有影响,且小时内处理组得到的原代细胞数与其它组别有统计学差异。.。此与徐燕瞄副研究报道的能获得.个细胞/相差较大,分析原因可能主要有两个方面:一是培养体系的差异,本实验的培养体系除%外不含任何促进细胞生长的生长因子成份;二是与脐带组织的新鲜程度有关,本实验结果可以看出脐带标本处理时间愈早,分离成功率越高,并且获得的细胞数量愈多。北京协和医学院硕士学位论文本实验分离获得的细胞其人脐带间充质干细胞常见表面分子、阳性,而造血细胞表面标记、为阴性或弱表达;?类分子表达为阳性,而?类分子表达为阴性;细胞周期显示,/期细胞占总体.%。在体外可诱导向成骨、成脂方向分化。上

38、述数据证明本实验应用组织块贴壁分离法可以获得人脐带间充质干细胞。在间充质干细胞产业化生产中需要操作简单,周期较短,成本较低的工艺方法。组织块贴壁分离法虽然可以获得贴壁的,但得到原代细胞的时间过长,占用细胞培养箱较多,加之在产业化生产运作中由于脐带运输采集过程中会遇到很多非可控因素,可能存在脐带采集后不能马上处理的情况,而此种分离方法与处理时间密切相关,随着处理时间延长,分离成功率呈现下降趋势。因此组织块贴壁法是否适合于产业化发展,有待进一步讨论。北京协和医学院硕士学位论文小 结.脐带组织块分离法可以获得原代贴壁的。.脐带组织块液氮冷冻后复苏也可以获得原代贴壁。.脐带组织的处理时间对分离的成功率

39、有影响。北京协和医学院硕士学位论文二、因子对原代人脐带间充质干细胞促贴壁生长的影响和均为体内一种活性物质,由体内一系列的酶联反应发挥促生长的作用,蟛刮等人在对人脐血间充质干细胞的无血清培养研究中表明添加和等因子可以促细胞增殖。【】等在人脐带间充质干细胞的传代培养中应用咖可以增强其贴壁生长。为了进一步提高人脐带间充质干细胞的得率,本实验在原代人脐带间充质干细胞的培养体系中添加和因子,讨论其对原代人脐带问充质干细胞贴壁生长的影响。实验方法.酶消化法分离人脐带间充质干细胞使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中取出,放入第一个烧杯中浸泡清洗。由镊子取出脐带放入其中一个大号培养皿中,并使用手术刀切除双侧手术线

40、结扎及淤血部分。用含双抗对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗,一般冲洗两遍,去除血污。将清洗干净的脐带置于另一个大号培养皿中,均分为?部分,平均每部分约长?。对每一小部分沿纵向进行分离,使脐带组织管状变为片状。将片状脐带组织进行进一步的分离,将剥离好的脐带组织进一步剪碎,成糜状后,先后移入两个烧杯中,充分清洗。将洗好的组织移入含有.%胶原酶的消化液中。加入.%胰酶补充消化。移入摇床,。,消化.个小时。将消化完全的消化液以目过滤网过滤,分装在两个烧杯内。将过滤后的液体分装在六个的离心管中,配平,离心,分钟。弃上清,用不含血清的/液进行洗涤和吹打。将洗好吹起的细胞悬液移入个离心管中,再次离心,

41、分钟。弃上清,用适量完全培养基重悬细胞后铺入孔板中培养。、因子对原代人脐带间充质干细胞的生长增殖的影响分别以完全培养基组含%的/培养基、组/细胞培养基、组/细胞培养基、组/细胞培养基重悬细胞,铺种至孔板,每组。于培养至第三设置三个复孔,使每孔细胞数达.,每孔体积北京协和医学院硕士学位论文天时按上述培养基分别换液,连续培养天。利用血球计数板进行台盼蓝染色计数。以公式计算原代细胞的促贴壁时间:/。:倍增时间,:细胞数由至的时间;:细胞数。.、因子对传代后人脐带间充质干细胞的细胞周期的影响对各组细胞进行传代培养,培养至第代,取对数生长期的细胞,应用“试剂盒进行检测,基本方法参见第一部分人脐带间充质干

42、细胞的细胞周期测定。.、因子对传代后人脐带间充质干细胞的细胞免疫表型的影响对各组细胞进行传代培养,培养至第代,取对数生长期的细胞,进行细胞免疫表型检测。具体方法参见第一部分人脐带间充质干细胞的细胞免疫表型的测定。.、因子对传代后人脐带间充质干细胞的诱导分化的影响将各组细胞传至第代,用胰酶消化,用含%的培养基中和消化作用,并吹打培养瓶壁,将吹打好的细胞悬液离心甲,分钟。用细胞培养基重新吹打重悬,每组均分为成脂诱导、成骨诱导及相应的阴性对照,铺种至孔板和孔板中。并对诱导两周后的细胞进行成脂和成骨染色鉴定,具体步骤参见第一部分实验方法、相关内容。.统计学处理统计学软件进行数据分析,应用统本实验采用研

43、进行图表绘制。计量资料以均数标准差表计表和研印 示。组间均数比较采用独立样本检验,以.为差异有统计学意义。北京协和医学院硕士学位论文实验结果.、因子对原代入脐带间充质干细胞贴壁生长的影响利用公式,计算得出:完全培养基组促贴壁时间平均为.小时,组为.小时,组为.小时,组为.小时。图对促贴壁时间进行统计学分析得出,组与完全培养组相比,.,组与完全培养组相比.,而组与完全培养组相比,.,具有统计学差异。幽缎簏蠛彝器缯缁貔绪彝纂地虬固钠绷黧垮棼錾争孵潮绷稳垮莽簇瓣峭孵夥贴綮时带来间/、邑筠 仃 电.幸牛. 宰宰. 倒置显微镜下观察,原代细胞接种后,细胞大部分贴壁,外观呈纺锤形和多角形。图.经过天培养后,镜下可见各组间细胞数量差异明显。其中,组、组细胞生长密集。图.?北京协和医学院硕士学位论文 . . . . . 北京协和医学院硕士学位论文.、因子对原代人脐带间充质干细胞对原代促生长情况对细胞生长曲线观察分析,四组曲线均为形,第?天为适应期,从第天起组增殖明显并进入对数生长期,且组细胞数