车前草黄酮类化合物的微波辅助提取工艺研究_毕业论文.doc

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1、闽南师范大学闽南师范大学 毕业论文毕业论文（设计）（设计） 车前草黄酮类化合物的微波辅助提取工艺研究车前草黄酮类化合物的微波辅助提取工艺研究 Study on Microwave-assisted Extraction Technology of flavonoids in Plantago asiatica 姓 名： 王冠枢 学 号： 091304138 系 别： 生物科学与技术系 专 业： 食品科学与工程 年 级： 2009 级 指导教师： 罗开梅 2013 年 4 月 30 日 I 摘要 研究车前草黄酮类化合物的微波辅助提取工艺。本实验建立在普通乙醇浸 提法的基础上辅以微波辅助提取的方法

2、，对车前草中黄酮类化合物提取的工艺 研究。本实验采用单因素试验确定乙醇浓度、料液比、微波时间、微波功率、 水浴时间、水浴温度等因素对车前草黄酮类化合物提取工艺的影响，利用正交 试验确定最佳工艺条件。结果表明:车前草黄酮类化合物微波辅助提取法的最佳 工艺条件为乙醇浓度70%、料液比140、微波功率700 W、微波时间80 s、水浴 时间1.5 h、水浴温度80，在此条件下车前草中黄酮类化合物提取率为 27.32%。微波辅助提取法相比普通浸提法用时短、提取率高。 关键词：车前草；黄酮；微波辅助；提取工艺 Abstract This is a study on microwave - assiste

3、d extraction technology of plantains flavonoid, which based on common ethanol immersion extraction accompanied by the microwave. The experiment applied single-factor test to confirm the influential elements of the extraction technology of plantains flavonoid, including ethanol concentration, solid-l

4、iquid ratio, microwave irradiation time, microwave power, time and temperature of water bath, and the orthogonal experiment to make sure the optimum technological conditions .The results showed that: the optimum conditions of microwave-assisted extraction plantain flavonoid were 70% ethanol concentr

5、ation, ratio of solid to liquid 1:40, 700 W microwave power, 80 s microwave time, 1.5 h bath time, and the temperature is 80 . The extraction rate of flavonoid under such circumstance was 27.32%. So, Microwave-assisted extraction is a time-saving and high-efficient method than ordinary extraction. K

6、ey words: Plantago major; flavonoids; microwave-assisted; extraction process 1 目录 摘要I 前言1 1 实验材料与方法1 1.1 材料1 1.1.2 试剂1 1.1.3 仪器2 1.2 实验方法2 1.2.1 样品处理.2 1.2.2 芦丁标准曲线的绘制.2 1.2.3 微波提取条件的优化.3 1.2.4 常规提取法与微波辅助提取法的比较3 2 结果与分析3 2.1 车前草总黄酮提取单因素实验3 2.1.1 乙醇浓度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响.3 2.1.2 料液比对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响

7、4 2.1.3 微波时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响.4 2.1.4 微波功率对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响.5 2.1.5 水浴温度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响.5 2.1.6 水浴时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响.6 2.2 正交实验.6 2.3 常规提取法与微波辅助提取法比较7 3 讨论7 参考文献：8 附表9 致谢12 1 前言 车前草是我国传统名贵中药，又名车前、车轮菜、猪耳草、钱串草等,为车 前科植物车前或平车前的干燥全草。连花茎高达 50 厘米，具须根。生长在山野、 路旁、花圃、河边等地。根茎短缩肥厚，密生须状根。叶全部根生，叶片平滑， 广卵

8、形，边缘波状，间有不明显钝齿，主脉五条。现代医学和中医药理研究表 明，车前全草中主要有效成分为乌苏酸、车前苷、环烯醚甙类成分，其中环烯 醚甙类包括桃叶珊瑚甙、梓醇、京尼平甙酸、蜜特力甙等；黄酮类如车前甙、 黄芩素等；此外还古有生物碱、蛋白质、氨基酸、大量脂肪酸类、固醇类及酚 酸类，在提高人体免疫能力、抗衰老、抑制肿瘤、补五脏虚劳、改善糖尿病症 状和萎缩性胃炎等方面有明显疗效1。 黄酮类化合物是一类存在于植物中的天然产物，在自然界中广泛分布，是 目前倍受关注的天然活性产物之一。黄酮类化合物又称生物类黄酮，是色原酮 或色原烷的衍生物，以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。 可分为黄酮

9、类、异黄酮类、黄酮醇类、黄烷酮类等，广义的范围还包括查耳酮、 异黄烷酮、双黄酮及茶多酚2。 黄酮类化合物具有广泛的生物学功能，包括抗氧化，降血脂，抑制血小板 凝聚，在生物体内有预防心血管疾病，防癌抗癌，调节免疫，抗衰老，抗菌杀 菌，提高记忆力，抗过敏，利胆等诸多药理作用及功效3-4。黄酮类化合物的抗 氧化功能与其他外源性抗氧化剂相比，具有无毒、安全和来源广等特点。 本实验运用微波辅助法对车前草中黄酮类化合物进行提取，测定其粗提物 中的黄酮含量，并与普通浸提法相比较，为车前草的开发利用提供理论参考依 据。 1 1 实验材料与方法实验材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 材料 原料：车前草，购

10、于漳州市芗城区北桥市场。 2 y y = = 1 15 5. .4 48 88 8x x - - 0 0. .0 08 85 58 8 R R2 2 = = 0 0. .9 99 99 9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 00.010.020.030.040.050.060.070.080.09 芦丁浓度（mg/mL） 吸光度 1.1.2 试剂 芦丁，无水乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。 1.1.3 仪器 HH-2 型数显恒温水浴锅：金坛市江南仪器厂；UV-2102 PC 型紫外可见分光 光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；LXJ-1IB 大容量多管离心机：郑州长 城

11、科工贸有限公司；DHG 型智能电热鼓风干燥箱（原 101 系列）：上海成顺仪 器表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品；电子天秤：北京赛多利斯天 平有限公司；微波炉。 1.2 实验方法 1.2.1 样品处理 将新鲜车前草洗净、清水漂洗并沥干其表面水分，于（801）鼓风干燥 48 h 左右，冷却后粉碎，过 40 目筛，装于试样瓶中，避光存放、备用。 1.2.2 芦丁标准曲线的绘制5-6 准确称取芦丁对照 8 mg，用体积分数 70%乙醇定容至 10 mL 容量瓶中，得 到 0.8 mg/mL 标准溶液。精密吸取标准溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL， 分别置于 10 m

12、L 具塞试管中，加质量分数 5% NaNO2 0.4 mL，放置 6 min 后， 加质量分数 10%硝酸铝 0.4 mL，放置 6 min，再加质量分数 4.3% NaOH 4 mL， 加蒸馏水至 10 mL，摇匀，放置 15 min，进行全波长扫描，在 510 nm 处有最大 吸收波长，以试剂作空白参比，测定吸光度。以芦丁浓度 x（mg/mL）为横坐 标，吸光度 y 为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法进行线性回归，得回归方 程，并求其相关系数。以测定结果得芦丁浓度与吸光度的标准曲线： y=15.488x-0.0858（x：浓度，mg/mL；y：吸光值）R2=0.999，其中芦丁的标准 曲

13、线 如 图 1。 图 1 芦丁浓度吸光值标准曲线 3 1.2.3 微波提取条件的优化7-8 影响车前草总黄酮提取的因素有很多，本实验首先选择 6 个影响总黄酮提 取的主要因素，在单因素试验中，研究了乙醇浓度 （50%、60%、70%、80%、90%） 、料液比 （110、120、130、140、150） 、微波时间（40、60、80、100、120 s） 、微波功率（140、280、460、595、700 W） 、水浴温度 （50、60、70、80、90 ） 、水浴时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）等对车 前草黄酮类化合物提取的影响。在单因素试验的基础上，设计了 L9 (34

14、)正交 试验，并进行试验验证。 1.2.4 常规提取法与微波辅助提取法的比较9 取车前草干粉末 3 份，每份 0.5g，分别放入小烧杯中，按 140（g/mL） 的比例加入 70%的乙醇 20 mL，将其放入 80 的水浴锅中回流提取 2 h，将提 取液进行离心后在 510 mm 下测其吸光度，计算出黄酮类化合物的含量，比较常 规提取法与微波辅助提取法的效果。 2 2 结果与分析结果与分析 2.1 车前草总黄酮提取单因素实验 2.1.1 乙醇浓度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 由图 2 可以看出，随着乙醇浓度的增加，车前草中黄酮类化合物含量增加， 当乙醇浓度达到 70%时，总黄酮类化合

15、物含量达到最高值；再继续增加乙醇浓 度，总黄酮量逐渐降低。乙醇的浓度低，渗透性小，影响黄酮的析出；乙醇浓 度过高可能导致车前草中黄酮被破坏，黄酮含量下降。当乙醇浓度在 60%80% 之间时，车前草总黄酮量趋于稳定，总黄酮量第一、二、三的乙醇浓度为 70%、80%、90%。因此，乙醇的最适浓度初步定为 70%。 4 0 5 10 15 20 25 5060708090 乙醇浓度（%） 黄酮类化合物含量（%） 图 2 乙醇浓度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 2.1.2 料液比对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 由图 3 可见，料液比为 110 时，由于溶剂量过少，可能导致黄酮不能完 全

16、被提取，因此黄酮含量较少，随着料液比增加，达到 140 时，黄酮类化合 物的提取量达到最大值，继续增加溶剂的量，黄酮类化合物含量反呈下降趋势， 可能因为溶剂量过多而黄酮类化合物含量所占比例下降。车前草总黄酮量随着 料液比的增加而呈现先升高后下降再上升的趋势，总黄酮量第一、二、三的料 液比为 1:40、1:20、1:50。因此，提取的最佳料液比初步定为 140。 0 5 10 15 20 25 30 1020304050 料液比（ml/g） 黄酮类化合物含量（%） 2.1.3 微波时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 由图 4 可见，随着微波处理时间的增加，提取液温度也随着增加，黄酮类 化

17、合物含量也相应增加，黄酮类化合物提取率上升，当微波时间达到 80s 时， 黄酮类化合物含量达到最大，当微波时间超过 80s 后，随着微波时间的增加， 黄酮含量呈下降趋势。可能是因为微波时间过长导致提取液温度过高，黄酮类 图 3 料液比对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 5 化合物受到破坏所致。车前草总黄酮量随着提取时间的增加而呈现较大的上下 波动，总黄酮量第一、二、三的提取时间为 80 s、120 s、100 s。因此，微波 处理时间初步定为 80s。 0 5 10 15 20 25 30 406080100120 微波时间（s） 黄酮类化合物含量（%） 2.1.4 微波功率对车前草黄酮类

18、化合物含量提取效果的影响 由图 5 可见，随着微波功率的增加，黄酮类化合物含量增加，当微波功率 达到 700W 时，黄酮类化合物达到最大值。车前草总黄酮量随着提取温度的增加 呈现较稳定的上升，总黄酮量第一、二、三的提取功率为 700W 、595W、460W。因此，提取的最佳微波功率初步定为 700W。 0 5 10 15 20 25 30 140280460595700 微波功率（W） 黄酮类化合物含量（%） 2.1.5 水浴温度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 由图 6 可见，水浴温度在 5090的范围内，随着温度的升高，黄酮类化 合物的提取量逐渐增加，但增加趋势不明显，水浴温度超过

19、80，黄酮类化合 物含量呈下降趋势，原因可能是水浴温度过高，导致车前草中的黄酮被破坏， 含量减少。因此，浸提的最佳水浴温度初步定为 80。但由于水浴温度对黄酮 图 4 微波时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 图 5 微波功率对车前草黄酮类化合物含量提取效果影响 6 类化合物的浸提影响不大，因此在正交试验确定最佳提取工艺时，水浴温度不 作为考虑因素。 0 5 10 15 20 25 30 5060708090 水浴温度（） 黄酮类化合物含量（%） 2.1.6 水浴时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 由图 7 可见，水浴时间在 0.51h 段内，黄酮类化合物含量缓慢增加， 12.5

20、h 段，黄酮类化合物含量有所增加，但增幅不大，可知，当水浴时间为 1.5h 时，车前草中黄酮类化合物已可以大量浸提。因此，最佳水浴浸提时间定 为 1.5h。由于水浴时间对浸提车前草中黄酮类化合物影响不大，因此在正交试 验确定最佳提取工艺时，水浴时间不作为考虑因素。 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 23.5 24 306090120150 水浴时间（min） 黄酮类化合物含量（%） 2.2 正交实验 由于水浴温度和水浴时间对车前草中黄酮类化合物的浸提效果影响较小， 因此在正交试验中不作为考虑因素，在乙醇浓度、料液比、微波功率、微波时 间 4 个单因素试验的基础上，

21、设计正交试验因素水平表（表 1） ，正交试验安排 及结果见表 2。 图 6 水浴温度对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 图 7 水浴时间对车前草黄酮类化合物含量提取效果的影响 7 表 1 因素水平表 水平 A 乙醇浓度 （%） B 料液比 （g/mL） C 微波功率 （W） D 微波时间 （s） 1 2 3 60 70 80 30 40 50 460 595 700 80 100 120 表 2 L9 (34 )正交实验方案及结果 试验 号 A 乙醇浓度 （%） B 料液比 （g/mL） C 微波功率 （W） D 微波时间 （S） 总黄酮得率 （%） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K

22、1 K2 K3 k k k R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 72.6178 72.7910 69.7591 24.2059 24.2636 23.2530 1.0106 1 2 3 1 2 3 1 2 3 67.9871 76.3426 71.8381 22.6623 25.4475 23.9460 2.7852 1 2 3 2 3 1 3 1 2 72.3655 72.7910 72.0114 24.1218 24.2636 24.0038 0.2599 1 2 3 3 1 2 2 3 1 78.9095 69.3260 69.9324 26.3031 23.1086 23.3108

23、 3.1945 23.5707 23.3032 23.7439 22.4446 27.2956 23.0509 20.9719 23.7439 25.0433 比较表 2 的三个因素的极差 R，D 的极差最大，其次是 B，再次为 A，而 C 的极差最小。因此乙醇浓度、料液比、微波功率、微波时间 4 个因素对黄酮类 化合物提取率影响的顺序依次为：微波时间料液比乙醇浓度微波功率。 以实际黄酮得率为指标，最佳提取条件组合为 A2B2C3D1，即乙醇浓度 70%、料液 比 140、微波功率 700W、微波时间 80s。在最佳提取工艺条件下，进行 3 次 平行验证性试验，以考察最佳条件的合理性和可靠性，

24、结果表明，在最佳提取 条件（A2B2C3D1）下，3 次验证试验结果非常接近，平均提取率为 27.32%。此结 果相比单因素实验中所有提取率都高，说明该提取工艺稳定，适合于提取车前 草中黄酮类化合物。 8 2.3 常规提取法与微波辅助提取法比较 按 1.2.4 设计的常规提取法提取车前草黄酮类化合物，结果显示，常规提 取法得到的黄酮类化合物的含量为 23.48%，而微波辅助提取发得到黄酮类化合 物含量为 27.32%。因此，微波辅助提取法不但节约了时间，而且效果优于常规 提取法，所以微波辅助提取法是很好的提取车前草黄酮类化合物的方法。 3 3 讨论讨论 进行单因素实验时，必须保证只有一个变量，

25、剩余其他因素均不变，否则 会影响实验结果。在进行水浴加热时，每个烧杯均用保鲜膜封住杯口，保证水 浸没烧杯内的溶液且受热均匀。做好防护措施，防止烧杯倾倒。在进行微波加 热时，每个烧杯均用保鲜膜封住杯口，用橡皮筋套住，利用间隔微波的方式进 行，防止因加热过快导致液体剧烈沸腾冲出烧杯。 本研究结果表明，乙醇浓度、料液比、微波功率、微波时间 4 因素对车前 草黄酮类化合物提取的影响主次顺序为：微波时间料液比乙醇浓度微波 功率，而最佳提取条件为 A2B2C3D1，即乙醇浓度 70%、料液比 140、微波功率 700W、微波时间 80s。在此条件下，车前草中黄酮类化合物的提取率为 27.32%。而常规法提

26、取率只有 23.48%，说明微波辅助提取法的效果明显优于常 规提取法。 目前，黄酮类化合物的各种性质研究越来越多，如果通过改进提取方法， 车前草中总黄酮含量得到提高，那么就能为社会提供更多的帮助，并取得人们 的信赖。若能继续研究获得更多的数据支持，就能应用到更多的领域，这是一 个很好的前景。 9 参考文献：参考文献： 1刘艳辉，赵映.车前草中黄酮类化合物的提取及其含量的测定J.湖南理工学院学报， 2009,22（2） ，63-64. 2耿敬章,冯君琪. 黄酮类化合物的生理功能与应用研究J.中国食物与营养， 2007,7:19-21. 3黄河胜,马传庚,陈志武. 黄酮类化合物药理作用研究进展J.

27、中国中药杂志,2000,25 (10):499-562. 4王玮,王琳. 黄酮类化合物的研究进展J.沈阳医学院学报,2002,4(2):115-119. 5 房方,张广强,谢新年.用分光光度法进行黄酮类化合物含量测定的研究J.河南中医药 学刊,1997,12(1):17-19. 6陈金娥，匡强民，张海容.正交优化-微波辅助提取银杏叶黄酮J.光谱实验室， 2011，28(2):623-626. 7王向国.良姜总黄酮提取工艺研究J中国野生植物资源,2010,29(4):47-49. 8连建国,孟庆杰,王光全,张凯.山楂新品种黄酮的提取与分析J.山东林业科技, 2010,191(6):12-14.

28、9梅洪睿,云霞,杨红.回归正交试验法优化菜芙蓉茎中总黄酮的提取工艺J.大连工业大 学学报,2008(4):297-300. 10李盈蕾,陈建华，陈亚洲.槲寄生总黄酮微波提取工艺及其抗氧化活性研究J.食品科 学,2010,31(12):62-66. 10 附附表表 表 1 标准卢丁浓度的吸光度 卢丁浓度（mg/mL） 吸光度 A 0.016 0.173 0.032 0.403 0.048 0.653 0.064 0.891 0.080 1.168 表 2 乙醇浓度对车前草总黄酮提取率的影响 表 3 料液比对车前草总黄酮提取率的影响 表 4 微波时间对车前草总黄酮提取率的影响 管 号 草质量 （g

29、） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时 间 （分钟） 水浴温度 （） 微波时间 （s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量 （mg/g） 10.5501:306080402800.17217.33368 20.5601:306080402800.18618.54643 30.5701:306080402800.22822.18468 40.5801:306080402800.22121.57831 50.5901:306080402800.19819.58593 管 号 草质量 （g） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时间 （分钟） 水浴温度 （） 微波时间

30、（s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量 （mg/g） 10.5701:106080402800.21420.97193 20.5701:206080402800.25624.61019 30.5701:306080402800.24423.51069 40.5701:406080402800.26825.64969 50.5701:506080402800.25324.35031 管 号 草质量 （g） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 微波时间 （s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量 （mg/g） 10.5701:306080402

31、800.20520.19231 20.5701:306080602800.22321.75156 30.5701:306080802800.25624.61019 40.5701:3060801002800.23322.61781 11 表 5 微波功率对车前草总黄酮提取率的影响 表 6 水浴温度对车前草总黄酮提取率的影响 表 7 水浴时间对车前草总黄酮提取率的影响 50.5701:3060801202800.23823.05094 管 号 草质量 （g） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 微波时间 （s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量

32、（mg/g） 10.5701:306080401400.21921.40506 20.5701:306080402800.22121.57831 30.5701:306080404600.24623.74394 40.5701:306080405950.26625.47644 50.5701:306080407000.27125.90956 管 号 草质量 （g） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 微波时间 （s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量 （mg/g） 10.5701:306050402800.22521.92481 20.5701

33、:306060402800.23022.35793 30.5701:306070402800.24523.65731 40.5701:306080402800.25124.17706 50.5701:306090402800.25824.78344 管 号 草质量 （g） 乙醇浓 度 （%） 料液比 （g：ml ） 水浴时间 （min） 水浴温度 （） 微波时间 （s） 微波功率 （W） 吸光值 A 黄酮量 （mg/g） 10.5701:303080402800.20219.93243 20.5701:306080402800.21020.62543 30.5701:309080402800.

34、24323.48406 40.5701:3012080402800.23923.13756 50.5701:3015080402800.24123.31081 12 致谢致谢 在我论文的选题、开题到成文全过程，我要感谢给过我很多帮助的老师和 同学。特别要感谢我的指导老师罗开梅老师，在我遇到难题的时候细心地为我 解答，在百忙之中还能经常抽空去实验室关心我的实验进度，也是由于罗老师 的指导，我才能在不断的失败中学习和总结，因此我在实验中的困难才能一一 攻克，最终顺利完成论文实验。在老师的指导下，我受益匪浅，学到了很多知 识，掌握了一定的实验操作技能，特别是学到了坚持不懈的精神。 本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感 谢实验室管理办公室老师给我的帮助和支持；感谢同学在论文设计和写作上给 我的建议和帮助。论文的完成与他们的帮助是分不开的，在此表示深深的感谢。 最后，我要向百忙之中抽出时间对本文进行审阅，评议和参与本人论文答 辩的各位老师表示感谢。