《随机扩增多态性DNA研究红小豆种质资源多样性毕业论文38772.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《随机扩增多态性DNA研究红小豆种质资源多样性毕业论文38772.doc（10页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、- 1 - 我国小豆种质资源遗传多样性我国小豆种质资源遗传多样性 RAPDRAPD 分析分析 摘要：摘要：利用 RAPD 技术对我国小豆的 8 个野生种、34 个地方种和 6 个已育成品种进行多态性研究。27 个 随机标记共扩增出 247 条 DNA 带,其中 214 条为特征带，占总数的 86.6%,说明我国小豆遗传多样 性丰富。当相似系数为 0.35 时，48 份材料可被聚为六类，从聚类结果可以看出，同一地域或气 候相似地区的材料较早聚为一类，说明供试材料遗传背景与其原产地背景相关，但有个别地区种 质资源的亲缘关系仍需进一步研究。 关键词：关键词：小豆 ； 种质资源 ； 遗传多样性 ； R
2、APD 分析 StudiesStudies onon thethe GeneticGenetic DiversityDiversity ofof ChineseChinese AdzukiAdzuki BeanBean GermplasmGermplasm ResourcesResources byby RAPDRAPD WANG PENG (The Department of Plant Science and Technology,Beijing Agriculture College, Beijing 102206) Abstract:Abstract: The genetic dive
3、rsity of 8 wild, 6 cultivars and 34 local Chinese adzuki bean varieties was assessed by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).285 bands including 214 polymorphic bands were identified with 27 RAPD primers makers. The rate of polymorphisms was 86.6%, which indicted there is of abundance in genetic
4、diversity of Chinese adzuki bean. The 48 cultivars were clustered in 6 groups as the coefficients was 0.35.The results of cluster combine showed that the samples from the cluster based on molecular maker is similar to that based on morphological makers except for parts of germplasm from some area. N
5、eed further research. KeyKey words:words: Adzuki；Germplasm Resources；Genetic Diversity；Analysis of RAPD 小豆（Adzuki）别名赤小豆、红豆、朱豆，是我国北方主要杂粮之一。中国种植小豆 的面积和产量均居世界首位。 小豆营养非常丰富，据测定，小豆籽粒中含蛋白质 19%29%、脂肪 0.4%2.7%、碳水 化合物 56%61%，每百克籽粒中含钙 67mg、磷 305 mg、硫胺素 5.2 mg、核黄素 0.11 mg、 尼克酸 2.7 mg。此外，还含有较多人体必需氨基酸及维生素等。小豆经济价值
6、很高，因其 适口性好，所以广泛应用于食品加工业。小豆也是重要的药膳原料，小豆籽粒性味甘酸， 无毒，入心、小肠经，有利除湿，和血排脓，消肿解毒之功能，小豆的叶、花和豆芽也能 入药治病。此外小豆的叶、秸秆还是营养丰富的优质饲料。不同小豆品种因其生物学特性 不同，其应用范围和利用价值也不尽相同，如豆沙用小豆、配菜用小豆等。 因此,深入了解小豆种质资源多样性及特异性对于开发小豆资源及小豆的综合利用尤 显重要。 - 2 - 目前我国小豆种质资源分类仅限于生态学上、细胞学上的分类及蛋白质水平上的分类： 中科院品资所胡家蓬（1984）5将全国收集到的 1040 份材料分别根据粒色、熟性、粒 重等性状特点进行
7、了较详细的分类，并根据各地方品种的特性将我国几个主要生产区初步 划分为四个小豆生态区：东北生态区、华北生态区、黄河中游生态区和云南生态区，而且 对各区进行了描述。 金文林（1985）6选择了与小豆有关的七个气候因子进行数值分析，初步将我国划分 为八个小豆生态气候区，进而对各小豆类型进行了讨论。 金文林等（1988）7通过对小豆染色体组型的研究，确定小豆染色体组型为: 2n=14M+6SM+2Sat。同时指出用于研究的 4 份材料染色体组型并无明显差异，从染色体角度 分析小豆的遗传多样性还需进一步研究。 金文林等（1997）8通过对十多种栽培小豆与野生小豆同工酶酶谱变异的研究，发现 利用三叶期幼
8、芽的 淀粉酶、萌动的种子子叶和三叶期的顶小叶的酯酶同工酶酶谱可将野 生种与栽培种、野生小豆与半野生小豆区分开。同时，研究还表明植物同工酶基因表达具 有时空性，不同的组织来源以及不同生育年龄的同一类酶表现出极大差距，易受其它因素 的影响。 对以上传统方法而言，植物种内个体之间的遗传鉴定以及亲缘关系是综合考虑其形态 学及农艺学特征或是通过生物化学分析方法检测来确定的，但这些方法容易受到环境的影 响，而且人们对其评估遗传亲缘关系的总体可靠性也存在一些争议( Gotllieb 19779； Brown197910)。因此目前人们普遍认为 DNA 水平上的多态性信息对于评判遗传多样性来说 是最好的。 此
9、次我们选用 RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA ）对小豆的种质资源多样 性进行分析。RAPD 技术是利用经 PCR 扩增出 DNA 片段通过电泳后，在琼脂糖凝胶上所表现 的 DNA 片段多态性来反映碱基序列的多态性。RAPD 分析时，一次分析只需一个引物，长度 为 10 个核苷酸左右，引物的序列是随机的，因而可在被检对象无任何分子生物学资料的情 况下，对其基因组进行分析。 Yang 和 Quiros(1993)1用 RAPD 标记对芹菜品种进行了鉴定及分类，通过 28 个引物检 测到的变异就可将 21 个品种分成 3 个不同的组，结果与原来的分类相吻
10、合。Hu 和 Quiros(1991)2也进行了相似的工作，他们只用 4 个随机十聚体引物就可以区分 14 个西兰 花和 12 个花椰菜品种，同时发现不同种子公司的品种之间的差异比同一公司品种间的差异 - 3 - 要大些，与预期的结果相同。此外，用这种方法还得到了其他一些植物种的特异表征图， 包括咖啡(Orozco-Castillo 等 1994)、可可(Wilde 等 1992)、马铃薯(Demeke 等 1993)、燕 麦(Dweikat 等 1993)、小麦(He 等 1993；Dweikat 等 1993；Josh 和 Nguyen 1993)和苹果 (Koller 等 1993；Mu
11、lcahy 等 1993)。邱丽娟等3以 57 个中国大豆祖先品系及育成品种和 18 个美国大豆品系为研究对象，结果表明，中国大豆种质与美国大豆种质不同，而且各国 南北方种质也不同。这一结果为丰富中国大豆品种遗传基础的种质选择提供了理论依据。 Makiko Mimura（2000）4研究发现栽培种及半野生种的变异较野生种的低，亚洲亚热带高 原国家（如尼泊尔）野生小豆其变异程度较亚洲远东国家的大。同时东南亚及亚热带高地 的栽培品种小豆显示出与远东区不同的 RAPD 的特点。他还假设栽培种小豆是由远东区野生 种驯化而来的，野生小豆种间的遗传多样性来自于其自身天然异化作用，而栽培种相对低 的变异来源
12、于驯化中人工异化作用。由此可见在进行家系分析、植物纯合系的鉴定、不同 变种的同源分析，以及对种子污染的检测等方面，RAPD 都具有重要的应用价值。 金文林等（2004）曾对 156 个亚洲小豆材料进行过 RAPD 分析，所用的 10 条引物在各 小豆种间均表现较高多态性，本课题在此基础上对我国小豆种质资源进行了更加详细的研 究。 - 4 - 1.1.材料与方法材料与方法 1.11.1 材料材料 国内 48 个小豆随机样本：地方种 34 个，野生种 8 个，已育成品种 6 个（见表 1） 。 表表 1 1 供试材料供试材料 TableTable 1 1 TheThe experimentalex
13、perimental materialsmaterials 编号品种名称来源地生育类型编号品种名称来源地生育类型 1JN002 北京育成 25 保 303江苏栽培 2B-1 河北育成 26 保 280安徽栽培 3 河北 801河北育成 27 保 276陕西栽培 4JN1 北京育成 28 保 170河南栽培 5JN2 北京育成 29 保 437四川栽培 6JN5 北京育成 30 保 605山东栽培 7 保 35北京栽培 31 保 285安徽栽培 8 保 144辽宁栽培 32AZN/94C02 贵州野生 9 保 328黑龙江栽培 33AZN/95C01 贵州野生 10 保 3吉林栽培 34 川 1
14、四川雅安严桥栽培 11 保 11吉林栽培 35 川 2四川雅安沙坪栽培 12 保 98吉林栽培 36 川 3四川荥经栽培 13 保 24辽宁栽培 37 川 4四川天全始阳栽培 14 保 55辽宁栽培 38 川 5四川阆中栽培 15 保 79辽宁栽培 39 川 6四川荣县栽培 16 保 45天津栽培 40Azn/94c04 贵州野生 17 保 68天津栽培 41Azn/97c01 云南野生 18 保 219山西栽培 42Azn/96c01a 云南野生 19 保 243山西栽培 43Azn/94c01 贵州野生 20 保 250山西栽培 44Azn/94c04c 贵州野生 21 保 528山西栽培
15、 45Azn/96c01b 云南野生 22 保 204山东栽培 46 新疆 1新疆昌吉栽培 23 保 305山东栽培 47 新疆 2新疆昌吉栽培 24 保 203江苏栽培 48 川 7四川阆中栽培 1.21.2 DNADNA 的提取与检测的提取与检测 将小豆种子播种在营养钵中，置于 20恒温培养箱，培养至三叶期。取三叶期幼苗嫩叶， 用冰块保温箱携至室内，将 1-2g 嫩叶放研钵中用液氮速冻，并快速磨碎。用 CTAB 法提取 DNA,并保存于 100l TE 中。使用前用灭菌蒸馏水将浓度调至 10ng/l。 1.31.3 RAPD-PCRRAPD-PCR 扩增扩增 反应液组成: 蒸馏水 15.1
16、l，模板 DNA 1l (10ng/l )，Mg2+ 2.5l (25mM)，dNTP 2.5l (2mM each)，10buffer 2.5l，引物 1.25l (10ng/l)，Taq 酶 0.15l - 5 - (5unit/l)，共 25l。以上药品购自上海 Sangon。 使用 PC-800 型 PCR 仪进行 RAPD-PCR 扩增，反应条件设定为 94预变性 2min；94变 性 30s、37复性 30s、72延伸 90s，40 次循环；72充分延伸 5min；4保存。对扩增 产物进行电泳:在电泳槽内加入 1 倍 TAE 缓冲液，将 2%琼脂糖凝胶浸没于缓冲液中， 将 15l
17、扩增产物与 1l 溴酚兰溶液充分混合后注入点样孔中，每板胶上留一个点样孔加 MARKER,通入 100V 电压。电泳结束后取出胶板，置于溴化乙锭中染色 20min，紫外灯下照相。 读数时以 MARKER 为参照，记录扩增后 DNA 片段位置，条带清晰可辩的记为 1，缺失的记为 0。 1.41.4 数据分析数据分析 试验数据用 Jaccard 遗传相似系数进行聚类分析，其公式：GSj=Na/（Na+Nb+Nc） ，其 中 Na 为两材料共有带数目，Nb 为 i 材料有而 j 材料缺失的条带数目，Nc 为 j 材料有而 i 材料缺失的条带数目。使用 SPSS11.0 软件中的聚类分析功能（Clas
18、sify）进行计算分析， 按照 with-in group 法聚类，并做出聚类图。 2.2.结果与分析结果与分析 2.12.1 RAPDRAPD 随机引物扩增结果随机引物扩增结果 采用上海 Sangon 公司生产的 10 碱基随机引物对 6 个材料（其中栽培种 2 个，半野生 种 2 个，野生种 2 个）进行初步筛选，从 48 个随机引物中筛选出谱带清晰并呈现多态性的 引物 27 个，对上述材料基因组 DNA 进行扩增。其中扩增谱带数较多的引物有 S265、S266， 扩增出 14 条带，具多态性的有 13 条，S37 也扩增出 14 条带，具多态性的有 11 条， S147、S154 扩增出
19、 13 条带，具多态性的有 12 条，能较好地表现出这些材料基因组 DNA 上 的差异。扩增谱带最少的 S277 只扩增出 2 条带，其中 1 条具多态性。 表表 2 2 2727 条引物序列及扩增的总条带与多态性片段数条引物序列及扩增的总条带与多态性片段数 TableTable 2 2 2727 primerprimer sequencessequences ,total,total numbersnumbers andand polymorphicpolymorphic bandsbands ofof PCRPCR amplifiedamplified productsproducts 序
20、号 引物引物序列扩增条带数 特征带 序号引物引物序列扩增条带数 特征带 1S35TTCCGAACCC111015S266AGGCCCGATG1413 2S36AGCCAGCGAA11916S277GTCCTGGGTT21 3S37GACCGCTTGT141117S313ACGGGAGCAA66 4S143CCAGATGCAC7418S321TCTGTGCCAC54 5S146AAGACCCCTC9819S326GTGCCGTTCA85 6S147AGATGCAGCC131220S328GGGTGGGTAA99 7S152TTATCGCCCC6621S338AGGGTCTGTG128 8S154
21、TGCGGCTGAG131222S361CATTCGAGCC54 9S155ACGCACAACC9923S442ACGTAGCGTC55 - 6 - 10S156GGTGACTGTG9624S452CAGTGCTGTG1010 11S157CTACTGCCGT9825S455TGGCGTCCTT87 12S160AACGGTGACC111126S460ACACACGCTG108 13S255ACGGGCCAGT111027S511GTAGCCGTCT65 14S265GGCGGATAAG1413total247214 图图 1 1 S266S266 扩增照片扩增照片 Fig.1Fig.1 Th
22、eThe RAPDRAPD photographphotograph byby primerprimer S266S266 27 个引物共扩增出 247 条 DNA 谱带，特异带 214 条，平均每个引物扩增 9.15 条谱带, 特异带 7.93 条，多态性为 86.6%。由于 RAPD 标记是一种显性标记，RAPD 分析时一条带代 表基因组一个位点的扩增产物， 此次扩增出的 247 条带相当于对这 48 个小豆种质基因组 的 247 个基因位点进行了检测，其中 214 条扩增带具有多态性，说明小豆在这 214 个基因 位点上存在着差异，86.6%的多态性频率说明，我国小豆种质资源具有丰富的遗
23、传多样性。 2.22.2、聚类结果、聚类结果 从图 2 中可以看出，当相似系数为 0.35 时，48 份材料可被聚为六类，第一类包括 15 个 种质（115 号） ，是来自东北、北京、河北的栽培种和已育成品种；第二类包括 16 个种质 （1624,2631 号） ，为我国中北部、东部地区栽培种；第三类包括 1 个种质（25 号） ；第 四类包括 2 个种质（3233 号） ；第五类包括 2 个种质（3436 号） ；第六类包括 12 个种质 （3748 号） ，来自我国西南、西北部地区。 3 3讨论讨论 3.13.1 RAPDRAPD 影响因素分析及解决办法影响因素分析及解决办法 在做预备试验
24、的时候我们发现，RAPD 较易受到各种因素干扰，无论是引物、模板 DNA、Taq 酶的质量或浓度的改变，还是退火温度的变化都可影响反应结果，导致电泳图谱 中弥散背景、扩增产物消失及电泳谱带位置改变，使 RAPD 重复较性差，稳定性不加。为了 尽量克服上述缺陷，要求我们在实验中做到：试验设计严密，试验设备调试精准，采用同 - 7 - 厂家同批号试验药品，试验操作准确、规范。 3.23.2 对总体的分析对总体的分析 从聚类结果可以看出，此次参测的 48 个种质的遗传差异基本随着地域差异 的加大而加大。同一地域或气候相似地 区的材料较早聚为一类，说明供试材料 遗传背景与其原产地背景相关。第一类： 东
25、北、华北大部分地区的栽培种与已育 成品种的种间遗传差异较小，说明当地 已育成品种是由这部分地区栽培种选育 的。东北地区是天然的早熟种质库，华 北的育成品种都有其早熟背景；加之， 近年我国小豆育种工作集中在这一地区， 使得这一地区栽培品种相对单一。第二 类：包括的我国中北部、东部的大部分 地区，每个地区种质不多，但仍可表现 出与其他地区的差异。第三类：为江苏 海安绿小豆，与其他小豆品种外观差异 明显。第四类、第五类、第六类：西南、 西北部的种质多为地方栽培种与野生种， 说明这些地区的栽培种是由当地野生种 进化而成，可能这一地区受地理条件的 限制，长期交通不便，人为选择、干扰 较小，使较原始的遗传
26、变异保留较多； 而相对于其他地区而言，这三类中的种 质资源间的遗传距离远，说明这些地区 是我国小豆天然远缘基因库， 这与以前的报道5,6是基本一致的。 - 8 - 3.33.3 对个例的分析对个例的分析 在图 2 中可以看到，两个天津品种（16，17）与山西品种（18-21）的遗传距离是最小 的，这是否表示天津的种质与山西的种质有着某种联系呢？ 笔者调查，天津属于一个移民城市，天津民间旧时曾流行着：“问我祖先来何处，山西 洪洞大槐树“的说法。据天津市历史博物馆陈列的志书所载，天津许多早期人物籍贯是山西， 文献中也有“自山西移民”的记载。试想现今天津的一部分人是从山西迁入的，则迁入的 山西人就可
27、能把山西的种质带往天津，这些种质在天津经过选择、培育，形成现在天津的 地方品种。这仅仅是笔者的假设，是否正确还需要两地更多的种质资源来做进一步论证。 由此想到，现在由于交通的日益发达，为引种工作提供了更加便利的条件，种质的流 动范围较之过去范围更大，流动速度更快，使种质资源的家系研究变得更加复杂。相同的 种质在不同生态区域的表现型往往有所差别，使用传统家系分析方法对这些种质资源进行 分析难免会产生误差或错误，这时利用分子生物学手段进行家系分析的好处就凸现出来了。 相信随着分子生物学实验方法进一步的改进，实验准确度进一步的提高，利用分子生物学 进行家系分析必将彻底取代传统分析方法。 - 9 -
28、4 4 致谢致谢 本文是在金文林老师和郭蓓老师悉心指导下完成，他们那精熟的专业知识、严谨的学 风、敏锐的分析能力给了我莫大帮助。 感谢秦岭老师对此文英文摘要部分的指导。 特别感谢文自翔师兄对我的帮助，我们从预备试验开始，同甘共苦，尝尽试验带给我 们的烦恼和喜悦，在实验过程中一同摸索，不断提高自己的实验水平和专业知识，为我们 试验圆满完成打下了坚实的基础。恭喜他顺利考取南京农业大学博士学位。 还要感谢一同做实验的王瑜、李志鹏同学及小豆组的老师、同学们，大家勤劳向上的 精神无时无刻不在感染着我，我十分荣幸能成为这个集体的一员。 最后，还有那二百多砵饱受摧残的小豆幼苗和超负荷运转的试验设备亦为我的实
29、验贡 献良多。 - 10 - 参考文献参考文献 1Clark Ms.植物分子生物学试验手册 1996：236-258 2Hu J, Quiros CF. identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers, Plant cell rep, 1991 10:505-51 3邱丽娟， RandallL， Nelson，etaL.利用 RAPD 标记鉴定大豆种质J,作物学报， 1997 3 23（4）: 408417 4Makiko Mimura, Kentaro Yasuda. RAPD variation
30、in wild, weedy and cultivated adzuki beans in Asia, Genetic Resources and Crop Evolution 2000, 47: 603-610 5胡家蓬.小豆资源研究初报，作物品种资源，1984 , 4: 9-12 6金文林.中国小豆生态气候区划， （油印本）北京农学院，1985 7郭淑华，金文林.小豆染色体组型分析，北京农业科学，1988，2: 19-22 8金文林，郝玉兰. 栽培小豆与野生小豆同工酶酶谱变异, 中国青年农业学术年报 B 卷 1997 18-22 9Gottlieb LD. Electrophoretic evidence and plant systematics, Ann Mo Gard 1977 64: 161- 180 10Brown AHD. Enzyme polymorphism in plant populations, Theor Appl Genet 1979 15: 1-42