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1、槟榔籽总酚的提取工艺优化和高效液相色谱-质谱分析毕 业 论 文 (设计) 题 目：槟榔籽总酚的提取工艺优化和高效液相 色谱-质谱分析摘 要本文以提取温度，提取时间和料液比为试验因素, 以总酚提取率为响应值，采用三因素五水平的二次通用旋转组合试验设计探讨槟榔籽中总酚提取的最佳工艺条件。在此基础上，采用高效液相色谱-质谱对槟榔籽提取物中主要酚类物质进行分析。结果表明，槟榔籽总酚的最佳提取工艺条件为：料液比10:1（v/w）,温度72，时间121min，提取率高达16.77%，用高效液相色谱分析提取物后发现两种主要的多酚为丁香酸和表儿茶素。关键词：槟榔籽；提取；总酚：高效液相色谱-质谱ABSTRAC
2、TOptimization of the extraction technology for total phenol from Areca catechu Linn seed was studied in the paper. The method of quadratic general rotary unitized design with 3 factors including extracting temperature, time and solvent-material ratio on the content of total phenol was adopted. On th
3、e basis, and the primary polyphenols in areca seed were identified by HPLC-MS. The results showed that the optimum extraction conditions are as follows: 70% ethanol, liquid to solid ratio of 10:1 (v/w), temperature 72C, time 121 min, giving a yield of up to 16.77%. Two phenolic compounds in the extr
4、act were identified by HPLC and their structures confirmed by electrospray ionization-mass spectroscopy: syringic acid and epicatechin.Key words: Areca catechu L; Extraction; Total phenols;Liquid chromatography- mass spectrography目 录 前言51材料与方法6 1.1主要材料6 1.2主要试剂6 1.3仪器设备6 1.4实验方法7 1.4.1 Folin-酚显色剂的配置
5、7 1.4.2总酚的提取7 1.4.3标准曲线的制作7 1.4.4总酚含量的测定7 1.4.5二次通用旋转正交试验8 1.4.6 HPLC提取物分析8 2试验结果及分析8 2.1标准曲线的绘制8 2.2二次通用旋转正交实验结果分析9 2.3响应面法实验结果分析-9 2.4HPLC提取物分析实验分析9 2.5验证实验10 3结论12致 谢13参考文献14前 言槟榔籽是棕榈科Palmae植物槟榔Areca catechu Linn.的干燥成熟种子1。我国海南，台湾是槟榔主要的种植区，广东，广西，云南，福建也有少量的种植，槟榔种植业已经是我国热带、亚热带地区仅次于橡胶的第二产业2. 由于槟榔抗性强，
6、适应性广，管理粗放，种植成本低，经济效益好，近年海南槟榔种植业发展较快，种植面积大幅度增加，目前，海南槟榔产量约占中国大陆产量的99%3，2011年海南省槟榔产量达到了17.47万吨，比上年增长了14.9%，发展前景十分广阔。槟榔全身都是宝，是世界三大口腔嗜好之一（香烟，口香糖，槟榔），全世界约有6亿人在食用槟榔嚼块4，在槟榔的加工过程中，槟榔籽是被丢弃的，但它占槟榔果总体积的45%。仅海南和湖南两省，一年产生的槟榔籽费料可达到数千吨，给环境清理工作带来了极大困难。因此，近几年在槟榔加工业诞生了一种槟榔籽废料回收利用的新商业生产模式。槟榔果含有丰富的多酚类物质和生物碱，具有较高的药理活性5,6
7、,7,8，经研究发现，槟榔籽中总酚的含量较高9。先前有研究表明，槟榔果中含有多种多酚类化合物，如类黄酮，木质素，芪均二苯代乙烯、羟基苯甲酸和羟基肉桂酸等，使其具有良好的抗氧化性。目前，LCMS 和 GCMS法已经可以准确的从植物浸提液和生物样本中分析出黄酮类和酚类物质的化学结构10,11，并且LCMS法已被用于鉴定食品样品中的酚类化合物12,13。因此，该研究以槟榔籽为原料，采用二次通用旋转正交实验对槟榔籽总酚的提取工艺进行优化，并用液质联用法对槟榔籽中两种多酚抗氧化成分进行分析鉴定，以便为开发利用槟榔籽提供理论基础和依据。1.材料与方法1.1. 原料槟榔籽，2012年6月采自海南岛。样品用蒸
8、馏水清洗后切成小片，在40C下通风干燥一整晚，粉碎过20目筛，以备用。1.2.主要试剂名称纯度生产厂商95%无水乙醇分析纯（AR）广州化学试剂厂乙酸乙酯分析纯（AR）广州化学试剂厂碳酸钠分析纯（AR）广州化学试剂厂氢氧化钠分析纯（AR）广州化学试剂厂酒石酸钾钠分析纯（AR）广州化学试剂厂硫酸铜分析纯（AR）广州化学试剂厂钨酸钠分析纯（AR）广州化学试剂厂钼酸钠分析纯（AR）上海国药集团化学试剂公司磷酸分析纯（AR）广州化学试剂厂浓盐酸分析纯（AR）广州化学试剂厂硫酸锂分析纯（AR）上海国药集团化学试剂公司儿茶素分析纯（AR）Sigma股份有限公司1.3.主要仪器仪器名称型号生产厂商数显恒温水浴
9、锅HH-S21.4金坛市医疗器械厂粉碎机180型广州旭朗机械设备厂旋转蒸发器R206B上海亚荣生化仪器厂紫外分光光度计722N北京瑞利分析仪器公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9075上海恒科技优先公司高效液相色谱电喷雾质谱联用仪Agilent 1100美国安捷伦公司二极管阵列检测器DAD美国安捷伦公司液相色谱柱ZorbaxSB-C18美国安捷伦公司1.4.实验方法1.4.1.总酚的测定参照文献14，取1ml样品液加1ml Folin-酚指示剂，3min后，再加入1ml饱和碳酸钠溶液，用蒸馏水稀释至10ml。在黑暗中反应90min，然后在725nm处测其吸光值。用儿茶素做标准曲线（2.0-12.0
10、 g/ml; y = 0.063x-0.0611; R2 = 0.9992) ，以儿茶素mg/100g 来记值，重复三次取平均值。1.4.2样品总酚提取率的测定总酚提取率（%）=（YV）/W100%式中：Y根据回归方程计算得到的总酚浓度，mg/mL； V总酚提取液定容体积，mL； W样品重，g。1.4.3.二次通用旋转正交组合设计实验 以影响槟榔籽总酚提取效果的料液比（X1）、温度（X2）以及时间（X3）为3个试验因子，以槟榔籽总酚的提取率（Y）为目标，3因素5水平的二次通用旋转组合设计，共计20个试验点，对槟榔籽总酚提取工艺进行优化。 确定零水平及变化区间如下：料液比以10为零水平，变化区间
11、为2；提取温度以75为零水平，变化区间为10；提取时间以120 min为零水平，变化区间为30 min。试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行15，编码因子见表1。表 1二次通用旋转组合设计因子水平表Table 1 the factor levels in quadratic general rotary unitized design 因素X1（料液比）X2（温度/）X3（时间/min）+1285150上水平（+1）11.281138零水平（0）1075120下水平（-1）8.869102-86590变化间距（j）1.26181.4.4.槟榔籽提取物的制备将槟榔籽洗干净，在40下烘干，粉碎
12、，过20-40目筛。分别取10g烘干粉碎的槟榔籽样品用70%的乙醇以一定的料液比在一定温度下回流提取。然后进行减压过滤，冷冻干燥浸提液。然后，用70%的乙醇配置成5mg/ml的工作液用来进行酚类和黄酮物质含量。取部分浸提液与100ml乙酸乙酯混合，用来进行多酚类物HPLC-ESI-MS分析。将悬浮物收集于棕色烧瓶，在-18下冷冻储存，用于进行LCESI-MS分析。1.4.5 LCESI-MS 测定方法色谱条件：流动相为乙腈（A）和0.5的甲酸（B）。色谱柱为洗脱流速1.0 ml /min，在5-25min使用8的梯度洗脱，在0 5min使用8-25的梯度洗脱，进样量为20l。化合物用二极管阵列
13、检测器在280nm的HP 1100系列紫外线（UV）波长下被分别检测到。用标样儿茶素、丁香酸作为参照物。质谱条件：ESI 离子源，离子源喷雾电压为5 kV，毛细管温度350 ，壳气（N2）流速35 pis，扫描范围为m/z 100800，正离子模式扫描。2. 结果与分析2.1槟榔籽总酚提取工艺优化以槟榔籽总酚提取率为指标，采用二次通用旋转组合试验设计对提取工艺进行了优化，试验结果见表 2。试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行。表2二次通用旋转组合设计试验结果Table2The test scheme and its results in quadratic general rotary u
14、nitized design of areca seedNX0X1X2X3X1X2X1X3X2X3X12X22X32Y(%)1111111111112.122111-11-1-111112.67311-11-11-111115.28411-1-1-1-1111114.1151-111-1-111117.0561-11-1-11-11116.4871-1-111-1-111112.3581-1-1-111111113.0791-1.682000002.8280010.371011.682000002.8280013.231110-1.682000002.828014.4112101.682000
15、002.82808.8713100-1.682000002.82810.85141001.682000002.82811.4115100000000016.0816100000000016.1617100000000016.0018100000000016.2419100000000016.3220100000000015.92数据测定三次(df = 3).根据多项式回归方程Y=b0+biXi+bijXiXj+Xii2，按照 20 个试验结果计算出所拟合的回归方程的各项系数，并根据试验结果进行方差分析（表3）可知，模型的拟合检验F2=31.5471F0.01（9，10）4.95，达到极显著水平
16、，复相关系数R20.966，说明该方程与实际情况拟合较好，正确反映了槟榔籽中总酚的提取率与料液比、温度和时间之间的关系。剔出=0.10 的不显著项后，建立提取率对试验因子的回归方程为：Y=16.10719+1.46739X1-1.88968X2-1.44363X12-1.50020X22-1.68051X32+0.91125 X1X2。表3实验结果方差分析 Table3 Variance analysis of test results变异来源平方和自由度均方比值F显著性水平PX129.4064129.406448.75280.0001X248.7673148.767380.85120.000
17、1X30.145910.14590.2420.6334X1230.034130.03449.79320.0001X2232.4338132.433853.7720.0001X3240.699140.69967.47480.0078X1X26.64316.64311.01340.7332X1X30.074110.07410.12290.8487X2X30.023110.02310.03830.0001回归171.2552919.0284F2=31.54710.0001剩余6.0317100.6032失拟5.919751.1839F1=52.85480.0001误差0.11250.0224总和17
18、7.286919采用频率分析法寻找最优工艺。对数学回归模型进行频率分析得到的结果见表4，在 95%的置信区间提取率大于12.95%的优化方案为：液料比10.06-10.84，提取温度 68.98-77.30，提取时间114.97-125.03min。为了贴近实际的工业化生产，将优化方案定为液料比为10：1，提取温度为72，提取时间为 121 min。对此方案进行试验验证得到提取率为 16.77%，与优化方案的理论值16.86%比较接近。表4各因素在组合应用中的频率分布Table 4 The probability distribution of Xi in the combined appli
19、cation因素水平X1X2X3次数频率次数频率次数频率-1.68200.00050.227300.000-130.136480.363650.2273090.409180.3636120.5455180.363610.045550.22731.68220.090900.00000.000x0.38-0.700Sx0.1670.160.14495%置信水平0.0530.707-1.0130.387-0.2820.282提取条件10.1-10.869-77115-1252.2 单因子效应分析为了进一步分析试验中料液比、时间、温度三个因素对试验结果的影响，采用了降维分析法，将其他因子固定在0水平，
20、进行单因子效应分析，得到下面单因子模型。Y1=16.10719+1.46739X1 -1.44363 X12Y2=16.10719-1.88968 X2 -1.50020 X22Y3=16.10719 -1.68051 X32根据上面模型作图，得到单因子效应曲线图1。从图1可以看出，随着因素X3（时间）的延长，总酚的提取率也随之增大，当编码值达到0.049019时，即提取时间为121.4706min时，提取率最高，与最有工艺相一致；但当提取时间X3的编码值大于0.049019时，随着时间的延长，总酚的提取率反而逐渐降低，由此可见，提取时间过长并不利于提取率的增加。X1（料液比）和X2（提取温度
21、）对提取率的影响规律基本与X3相同，不同的之处在于X1（料液比）在编码值达到0.343763时，即料液比为10.6865时，其提取率最高，而X2（提取温度）则在编码值达到-0.52629时，即提取温度为69.7371时，其提取率最高。图1 单因子效应曲线Fig. 1 Effect of single factor on extraction yield2.3双因素交互作用分析 将建立的回归模型中的任一因素固定在零水平，得到另外两个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线见图2-4。 从图2可以看出，随着料液比的增大和温度的升高，总酚的提取率先增加而后又缓慢下降，当料液比在10.60：
22、1、提取温度在72.03附近时，提取率达到最大值；提取率对料液比的变化比对提取温度的变化敏感。 从图3可以看出，随着料液比的增大和提取时间的延长，总酚的提取率先增加而后又缓慢下降，当料液比在10.60：1、提取时间在120 min附近时，提取率达到最大值；提取率对料液比的变化比对提取时间的变化敏感。从图4可以看出，随着提取温度的升高和提取时间的延长，总酚的提取率先快速增加而后又缓慢下降，当提取温度在77.97、提取时间在120min附近时，提取率达到最大值；提取率对提取温度的变化比对提取时间的变化敏感。综合以上分析，料液比是影响槟榔籽总酚提取率的主要因素，其次是提取温度，而提取时间对槟榔籽总酚
23、提取率的影响较小。图2料液比和温度交互作用Fig. 2 Interaction of liquid and solid ratio(v/w) and temperature 图3料液比和时间交互作用Fig. 3 Interaction of liquid and solid ratio(v/w) and time 图4 温度和时间交互作用Fig. 4 Interaction of temperature and time 2.4 槟榔籽酚类化合物的分析鉴定利用HPLC 中的DAD 检测器对每一个乙醇提取物色谱峰进行光谱扫描分析，为了进一步确定其结构信息，试验选择正离子模式扫描，槟榔籽粒乙醇提取
24、物中2个抗氧化成分进行了HPLC-MS 分析。其分析结果见图5、图6和图7和表5。由电喷雾质谱分析表明，槟榔籽乙醇提取物中乙酸乙酯部分中的主要酚类成分为表儿茶素（C15H14O6；MH+ 291.27）和丁香酸 （C9H10O5；MH+ 199.17）。槟榔果不同部位的酚类物质成分不同，但在槟榔果中并没有发现有大量的丁香酸和表儿茶素。目前已有一些关于槟榔果的成分和药理功能的报道，如从槟榔果种提取出多种单宁酸，Arecatannin A1、Arecatannin A2、Arecatannin A3、Arecatannin B1、Arecatannin B2 and Arecatannin C1,
25、 等。从槟榔醇提物中提取出了五种酚类化合物：异鼠李素、金圣草黄素、毛地黄黄酮、()-4,5-dihydroxy-3,5,7- trimethoxyflavonone 和巴西红厚壳素，但槟榔籽总酚物质的含量的报道很少见。图5 丁香酸和表儿茶素混合标准溶液的HPLC图Fig.5 Chromatogram of syringic acid and catechin Blended standard solution图6 槟榔籽70%乙醇提取物中丁香酸和表儿茶素的色谱图Fig.6 Chromatogram of syringic acid and catechin of 70% ethanol ext
26、ract in Betel nut图7 MS- MS谱如下：a丁香酸，丁香酸异构体的质谱。 b儿茶素和儿茶素异构体的质谱Fig.7 a mass spectrogram of syringic acid and syringic acid isomeride. b mass spectrogram of catechin and catechin isomeride表5 两种酚类化合物高效液相色谱-质谱信息Table5 Spectral information of LC-TOF-MS for 2 phenolic compounds酚类化合物分子量 M-H+（质谱片段）保留时间（min）1丁
27、香酸198199 (183,154)11.622表儿茶素290291 (246,180,126)12.673. 结论（1）采用双因素交互作用分析发现料液比是影响槟榔籽总酚提取率的主要因素，其次是提取温度，而提取时间对槟榔籽总酚提取率的影响较小。本实验通过二次通用旋转正交组合设计优化槟榔籽总酚的最佳提取工艺条件为：料液比10:1（v/w），温度72C，时间121min，提取率高达16.77%。（2）用高效液相色谱-质谱鉴定出两种主要的多酚化合物分别是表儿茶素和丁香酸致 谢本次毕业论文的完成,我要感谢张伟敏老师。在论文收集资料、实验设计、论文进展、论文撰写方面,张老师都给予了宝贵的意见和极大的帮助
28、。在实验过程中遇到什么困难时，张老师都能及时帮忙解决，张老师用严谨的学术作风、和蔼可亲的生活态度、以及对学生积极负责的态度，给予学生在学习和生活方面细致入微的关怀，使我受益匪浅，在此表示万般感激之情和深深地敬意。在此毕业论文完成之际，也向所有关心过、帮助过我的老师和同学表示诚挚的感谢和美好的祝愿，向食品学院全体老师表示衷心感谢，感谢他们在我学习期间给予的支持和热心帮助。参考文献1 李海忠，钟海雁，郑锦星等.槟榔提取物在小鼠体内的抑菌作用J.食品与机械，2007（10）：81-832 黄永华.槟榔有效化学成分分析测定J.食品与机械，2002（3）：38-39 3 省农业厅提出解决槟榔产销问题的建
29、议 20084 曾琪，李忠海，袁列江,等.槟榔生物碱的研究现状及展望J.食品与机械,2006,(11):158-1615Wang CK, Su HY, Li CK. 1999. Chemical Composition and Toxicity of Taiwanese Betel Quid Extract.Food and Chemical Toxicology37:135-144.6Zhang X, Mei WL, Zeng YB, Liu J, Dai WJ, Dai HF.2009. Phenolic Constituents from the Fruits of Areca cate
30、chu and Their Anti-bacterial Activities. Journal of Tropical and Subtropical Botany1: 74-76(In Chinese).7Zhang CJ, Lv FJ, Tao HT. 2008a. Advances of Research on Bioactivity components and function of Areca nut. Food and Nutrition in China6:50-52(In Chinese).8Zhang CJ, Lv FJ, Tai JX. 2008b. Quantitat
31、ive determination of total phenolics and tannin in areca nut and its products. Food Res Dev 6: 119121 (In Chinese).9Zhang WM, Li B, Han L, Zhang HD. 2009. Antioxidant acitivties of the extracts from betel flower, husk and seed. African Journal of Biotechnology16: 3887-389210Bravo L. 1998. Polyphenol
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