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1、鸡蛋中磺胺二甲嘧啶残留量的HPLC检测方法的建立 摘要：本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定了鸡蛋中磺胺二甲嘧啶（SM2）的残留量。实验通过在鸡蛋样品中添加0、0.125、0.25、0.5ppm的SM2，再经过乙腈-氯仿混合溶液提取和硫酸钠溶液反萃取净化及正己烷去脂等处理后，选用紫外285nm的波长，HPLC测定,出峰时间在7min左右，标准曲线的相关系数为0.9996，SM2的回收率为56.7%-60.8%。在目前的检测条件下，检测不出鸡蛋中的SM2残留。关键词：磺胺二甲嘧啶、鸡蛋、高效液相色谱1. 前言鸡蛋是人们的主要食物之一，也是天然营养食品。它以营养丰富、易于吸收和价廉物美而深受消费
2、者喜爱，鸡蛋的消费量在人民膳食结构中占有重要地位。但由于蛋鸡饲养业的集约化和追求蛋品的高生产率，造成在鸡蛋的生产过程和蛋鸡饲养中要使用一些药物来保障畜群的安全或拌入饲料以促进动物的生长及提高产量。磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是一类人工合成的具有氨基苯磺胺基本结构的抗菌药。磺胺二甲嘧啶（SM2）为磺胺类药物之一，化学名称为对氨基-N-（4，6-二甲基-2-嘧啶基）苯磺酰胺，是一种广谱抗菌药，为白色结晶粉末，长期暴露于日光下，颜色会逐渐变黄，无臭，基本无味，相当稳定，微溶于水，易溶于乙醇和丙酮, 在氯仿和乙醚中几乎不溶解。由于它的化学结构和细菌的“生长物质”-对氨苯甲酸结构很相似
3、，可通过与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，妨碍二氢叶酸的形成，最终影响细菌核蛋白的合成，从而达到抑制溶血性链球菌、肺炎球菌以及大肠杆菌等细菌的作用。养殖业用它控制或预防雏鸡自痢杆菌病、禽霍乱等细菌性疾病和球虫病。我国现行法规是允许使用的，并且规定药物混料的预防量按照0.2%加入，治疗量一般不允许超过0.5%，连续使用不宜超过7天。但是饲养者和饲料加工者的使用上可能存在不符合国家规范的问题，这就要求对食品和饲料中SM2的残留量进行检测。李俊锁、李西旺等用高效液相色谱法对鸡肝中磺胺类药物多残留进行了分析1。 Aerts等采用低压恒流模式2、Tsai等采用化学发光高效液相色谱方法3 、Furusawa
4、 等4 通过高效液相色谱自动检测肉、蛋、奶中的磺胺类药物。Muldoon 等采用单抗为基础的竞争抑制性酶联免疫反应(cELISA)检测鸡肝脏组织中SDM残留5。2002年，Furusawa等又通过高效液相色谱检测了孵化期母鸡鸡肉及鸡蛋形成过程中四种磺胺类药物SDZ、SOD、SMX、SQ6。随着我国加入WTO以后和人们对食品安全认识的不断深入，为保障我国人民身体健康、对鸡蛋食品实施有效监控、应对国外的绿色壁垒，提升我国鸡蛋产品的市场竞争力、研究、建立鸡蛋中磺胺二甲嘧啶的检测方法意义重大。目前，在国内对鸡蛋中磺胺二甲嘧啶残留的检验还没有成熟的方法，还不具有做低压恒流模式和化学发光高效液相色谱的条件
5、，因此，本实验参考出口肉中磺胺药物残留的HPLC检测方法，拟研究建立鸡蛋中磺胺二甲嘧啶的HPLC检测方法。2. 材料与方法2.1 实验材料 苏果超市购得南通大地公司产新鲜鸡蛋120个 2.2 药品与试剂 乙腈(色谱纯)、氯仿（分析纯，RA）、正己烷（RA）、无水硫酸钠（RA） 磺胺二甲基嘧啶(SM2，标准品含量为99.99%Sigma) 乙酸（37.6%）2.2.1 SM2的储备液和标准工作液的配制储备液：万分之一电子天平精确称取25mgSM2， 用乙腈溶解并定容到10ml容量瓶,混匀,浓度为2.5mg/ml。标准工作溶液：临用前用乙腈的乙酸水溶液(乙腈：乙酸：水=18：1：81)稀释成工作液
6、，浓度分别为0.05，0.125，0.25，0.50，25 ug/ml。注：乙腈：乙酸：水(18：1：81)为本实验中色谱仪所用流动相。2.2.2 SM2的萃取液10%硫酸钠水溶液（m/V） 2%硫酸钠水溶液（m/V） 乙腈:氯仿混合溶剂（10：1=V：V）乙腈:氯仿混合溶剂（1：2=V：V）： 2.3 仪器与设备高效液相色谱 美国Aglilent 1100S台式高速离心机(Biofuge stratos) 美国Kendro氮吹仪Nitrogen EVAPORATOR 美国Organomation Associates,Jnc微型高速万能试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司1/万T-1000型电
7、子天平 常熟双杰测试仪器厂高速组织捣碎机 上海标本模型厂 旋涡混合器 上海琪特仪器有限公司2.4 样品预处理2.4.1 鸡蛋样品制备：鸡蛋去壳，蛋白蛋黄匀浆，2.4.2 磺胺二甲嘧啶的提取：分别称取2.00g鸡蛋匀浆,加入0.5ml10%硫酸钠水溶液和4.4ml乙腈-氯仿混合溶剂(10：1)，旋涡振荡成匀浆, 再离心3分钟(3500r/min)。将上清夜转入15ml离心管，再用2ml乙腈-氯仿混合溶液(10：1)提取,离心3分钟(3500r/min)，提取液并入上一支离心管，共约5ml。2.4.3 提取液的干燥：将该离心管置于氮吹仪中，于40蒸发至干。2.4.4 提取物的脱脂：在含有提取物的试
8、管中加入1ml2%硫酸钠水溶液和2ml正己烷,在旋涡混合器上剧烈振荡混匀,使其溶解,离心3分钟(3500r/min)。弃去正己烷层。再用2ml正己烷洗水相一次,同法弃去正己烷层。2.4.5 反向萃取磺胺二甲嘧啶：加3ml、2ml乙腈-氯仿混合溶液(1：2)，与旋涡混合器上剧烈振荡混匀，离心3分钟(3500r/min)。2.4.6 下层沉淀物：将含有提取并浓缩后的磺胺二甲嘧啶的下层物质（估计为有机相），转入另一支离心管内，并于氮吹仪中吹干。2.4.7 上机样品的制备：吹干后的剩余物用流动相溶解并准确定容至1ml，离心5min（16000r/min），上清液过0.45um滤膜，滤液上机检测。2.5
9、 标样回收率的检测：在制备好的鸡蛋样品中分别添加0ul（0ppm）、10ul(0.125ppm)、20ul(0.250ppm)、40ul(0.500ppm)的浓度为25ug/ml的标准工作液。按照上述2.4的方法进行处理、作色谱分析，根据标准曲线或回归方程计算。2.6 紫外-HPLC检测方法的条件建立2.6.1 检测仪器：紫外高效液相色谱2.6.2 色谱条件：流动相：乙腈的乙酸水溶液 色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6250mm，5um）波长：285nm柱压：142 bar柱温：20流量：1.1ml/min进样量：20ul3. 结果与讨论3.1 样品提取方法的选择提取样品中SAs的方法
10、多种多样，可以用乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等单一溶剂提取，可以是混合溶剂提取，以及酸碱缓冲溶液提取等等。各种方法的提取效率没有明显差异。根据药物种类、样品基体性质的不同而有所不同。药物的种类不同，其溶解性不同，采用的提取溶剂也就不同。磺胺二甲嘧啶属于酸碱两性药物，但主要呈弱酸性，极性较高，在不同的溶剂中均有一定的溶解度，一般采用极性溶剂提取和碱性溶液与溶剂反萃取净化的方法处理样品10。鸡蛋样品中的脂肪、蛋白质含量比较高，所以宜采用极性有机溶剂进行提取。本方法用乙腈-氯仿混合溶剂提取，因为乙腈具有强的沉淀蛋白质能力和很高的溶解性，能有效将与组织非共价结合的SAs解离和提取，使乳化减少，回收率较高。
11、3.2 脱脂方法的选择 用乙腈提取样品时有可能提取出脂类，我们采用正己烷萃取脱脂，减少样品中的脂溶性杂质对分析柱的污染。3.3 检测波长和柱温的选择取0.25ug/ml的标准工作液在紫外光谱下进行扫描，在280nm和285nm有最大吸收，285nm处的杂峰较少，所以选用波长为285nm。SM2在40以上极不稳定，故温度不能过高，而在温度较低时，流动相粘度较大，出峰时间较长，所以选用柱温为20。3.4 不同浓度的标准液的HPLC图谱ABCD图1 A：0.050ppmSM2的HPLC图谱 B：0.125ppm SM2的HPLC图谱C：0.250ppmSM2的HPLC图谱 D：0.500ppm SM
12、2的HPLC图谱表1编号参考指标ABCD出峰时间（s）7.1377.1137.1057.065峰面积1.54.28.818.1 按上述色谱条件，采用外标标准曲线法对样品进行定量，分别取20ul 标准工作溶液进行高效液相色谱测定，以峰面积和浓度关系绘制标准曲线。经回归分析，方程为Y=0.0274X+0.0064， R2=0.9996。3.5 回收率检测AB图2 A：未添加SM2的鸡蛋样品的HPLC图谱 B：添加0.125ppm SM2 的鸡蛋样品的HPLC图谱未添加SM2的鸡蛋样品的HPLC图谱中，在7分钟左右没有很大的峰出现，估计是没有SM2的残留，但是可以看到一个很微小的峰，说明也有可能是S
13、M2 已经分解成为其它物质。AB图3 A：添加0.25ppm SM2的鸡蛋样品的HPLC图谱（1） B：添加0.25ppm SM2 的鸡蛋样品的HPLC图谱（2）AB图4 A：添加0.5ppm SM2的鸡蛋样品的HPLC图谱（1） B：添加0.5ppm SM2 的鸡蛋样品的HPLC图谱（2）图3和图4的A图谱和B图谱相比，A图谱中的杂峰数明显少于B中的杂峰数， 可能由于样品处理的过程存在差异，说明还需要进一步探索并优化样品的预处理方法。表2 回收率结果样品号添加量(ppm)测得值回收率(%)100020.125456.730.1255.340.25011.459.650.2509.660.50
14、20.160.870.5024.2回收率结果偏低的原因估计是因为药物提取操作过程中有一定的损失。4. 结论 在本次实验的色谱检测条件下，选取C18柱、285nm的波长，样品出现了较高的吸收峰。样品上机后的图谱中，出峰时间在7min左右，比较稳定，但是，平行样品之间的杂峰数量差异较大，可能由于样品的前处理过程还不够完善，有待于进一步的改进。本方法测定鸡蛋中SM2的残留量结果不太稳定，在高浓度添加样品表现出了较高的回收率，但在低浓度的回收率较低，可能由于鸡蛋的结构成分较肉样和饲料更为复杂，以及与蛋黄和蛋白的PH不同等一些因素有关。要建立成熟的方法，有待于进一步研究筛选样品的提取和制备条件。参考文献
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20、raphy (HPLC) in Egg Abstract: This paper researches the determination of SM2 by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in eggs. The condition of chromatography in feed was as follows: using 20RBAX SB-C18 column (4.6 250mm, 5um), and CH3CN (V)/CH3COOH(V)/water(V)(18:1:81) as mobile phase with the speed of 1.1ml/min,and the detection wavelength was 285nm. The time of peak is about 7 minutes. The recovery of SM2 was 56.7%60.8%. In the condition of recent determination, there was no SM2 in eggs .Key words: Egg; SM2 ;HPLC9