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1、 本科生毕业论文 题 目 基于基因组重排技术的角蛋白酶 高产菌株的筛选 学 院 轻纺与食品学院 专 业 轻工生物技术 学生姓名 程 双 学 号 1043095006 年级 2010级 指导教师 吴 重 德 二一 四 年 六 月 四 日四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选专业：轻工生物技术学生：程 双 指导老师：吴重德摘 要角蛋白酶以其特异性分解角蛋白的特性，在废弃羽毛的处理，清洁制革技术等领域中得到广泛应用。本论文以实验室保存的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis X-47)作为亲本菌株，利用基因组重排
2、技术，筛选高产角蛋白酶的菌株。对基因组重组的条件进行了优化，得到Bacillus licheniformis X-4的最佳基因组重排条件为：菌龄8 h，溶菌酶酶浓度1.0 mg/mL，酶解时间30 min，酶解温度40，融合时间15 min，融合温度35，融合pH9.0，融合PEG浓度400 g/mL。通过筛选得到第一代融合子Y1-28和Y1-31，Y1-28角蛋白酶活力为240.97.2 U/mL，Y1-31角蛋白酶活力为257.517.5 U/mL，较原始菌株分别提高了68.4%和80.0%。以Y1-28和Y1-31为亲本，筛选的第二代融合子Y2-33角蛋白酶活力为318.231.2 U/
3、mL，与较原始菌株相比提高了122.4%。关键词：基因组重排技术 角蛋白酶 地衣芽孢杆菌Screening of high keratinase-producing strains by genome shuffling Major: Biotechnology for Light IndustryStudent: Cheng Shuang Supervisor: Wu ChongdeAbstractKeratinase, specialized in degradation of keratin, is used extensively in the treatment of waste f
4、eather and the technology of clean production in leather industry. This manuscript aimed to screen high keratinase-producing strain through genome shuffling by using Bacillus licheniformis X-47 as parental strain. The conditions for genome shuffling were optimized. the optimal cell age was 9 h, and
5、the optimal lysozyme concentration, enzymatic time, and temperature were 1.0 mg/mL, 30 min, and 40, respectively. The fusion time, fusion temperature, pH, and PEF concentration were 15 min, 35, pH 9.0 and 400 g/mL, respectively. Under the optimal conditions, the first generation of fusants Y1-28 and
6、 Y1-31 were screened, and the keratinase activities were 240.97.2 U/mL and 257.517.5 U/mL, which increased 68.4%, and 80.0%, respectively, compared to the parental strain. The second generation of fusant Y2-33 was isolated by using Y1-28 and Y1-31 as partental strains. The activity of Y2-33 was 318.
7、231.2 U/ml which increased 122.4% compared with the original strain.Key words：Genome shuffling Keratinase Bacillus licheniformisi目 录第一章 前言11.1 角蛋白酶概述11.1.1角蛋白及其利用11.1.2角蛋白酶的研究11.2 基因重排技术（Genome shuffling）21.2.1基因组重排技术原理21.2.2基因组重排技术方法21.2.3基因组重排技术的优点31.3 本论文研究的目的意义、思路设计及主要内容41.3.1研究目的意义41.3.2论文设计思路4
8、1.3.3主要内容5第二章 材料与方法62.1 实验材料62.1.1菌种62.1.2药品与试剂62.1.3培养基72.1.4主要仪器设备72.2 实验方法72.2.1角蛋白酶活力分析方法72.2.2原生质体的制备和再生82.2.3原生质体的灭活82.2.4原生质体的融合及其条件优化82.2.5融合子的检出9第三章 结果与讨论103.1 最适菌龄的确定103.2 酶解最佳条件的确定103.2.1溶菌酶最佳浓度的确定113.2.2最佳酶解时间的确定123.2.3最佳酶解温度的确定123.3 酶解后原生质体形成率、再生率和灭活率133.4 原生质体融合条件的优化143.4.1原生质体融合最佳温度的确
9、定143.4.2原生质体融合最佳作用时间的确定153.4.3原生质体融合最佳PEG浓度的确定163.4.4原生质体融合最佳pH的确定173.5 B. licheniformis X-47的基因组重排173.5.1 第一轮基因组重排173.5.2 第二轮基因组重排18结 论20参考文献21附录1 Lowry法测定蛋白质含量24声 明25致 谢26第一章 前言1.1 角蛋白酶概述1.1.1角蛋白及其利用角蛋白是自然界中最丰富的蛋白质之一，人的毛发，动物的羽毛、爪子等都存在大量角蛋白1。角蛋白由于其构型的不同，我们把它分为和两个类型的角蛋白，人类和动物的毛发就是主要由-角蛋白构成。-角蛋白多见于羽毛
10、中，来自-角蛋白的可逆转变，以氢键连接而堆叠成多层结构组织。因角蛋白含硫量的不同，故又把它分为硬角蛋白和软角蛋白。硬角蛋白也被称为真角蛋白，它拥有含脂类少、结构牢固、含硫量高、组织紧密等特点；而软角蛋白又被称为假角蛋白，它的含硫量不超过3%，脂类较多，组织结构柔软而疏松，不耐热，但其伸缩性比硬角蛋白要好2-4。高度交联的胱氨酸残基二硫键、氢键以及分子间疏水的相互作用使得角蛋白化学性质稳定，机械强度高，导致角蛋白难以被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等我们常见的一般蛋白酶所水解5。角蛋白不能被畜禽直接吸收利用，必须经过高温、高压处理或者酸、碱、酶作用，变成短肽或游离氨基酸，才可以被畜禽利用。羽毛是
11、家禽经过一定处理后废弃的产物，每年废弃羽毛的数量相当巨大，全球达到了几百万吨。作为角蛋白的主要来源，羽毛拥有极高的蛋白质含量，在作为优质蛋白质使用上具有巨大潜力 6-7。同时，羽毛角蛋白还可以作为优质的饲料或者饲料添加剂8-9。角蛋白的应用十分广泛，它还可以用于生产氨基酸微量元素鳌合剂,与微量金属离子反应，生成稳定安全的环形结构化合物，从而可以提高微量元素的利用率。反应生成的鳌合物易于吸收利用，能够有效改善动物体内的生理机能10。由于全球鸡养殖的数量巨大，基于简单的生产工艺，使得鸡羽毛制复合型氨基酸铁成本低廉，有助于推广11。1.1.2角蛋白酶的研究Nickerson等12在1963年第一次提
12、出了拥有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。角蛋白酶能够特异性降解角蛋白，将角蛋白水解成较短的肽链或者游离的氨基酸。自然界中能够分泌角蛋白酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌等。角蛋白酶是一种诱导酶，需要羊毛等角蛋白外部诱导才能生成。Wawrzkiewica等13发现羽毛角蛋白可诱导Trichophyton gallinae的角蛋白酶的表达。再比如链霉菌分泌的角蛋白酶，如果没有诱导物进行培养，角蛋白酶产量只有原来的1/5.7114。微生物分泌的角蛋白既有胞内酶又有胞外酶，但大多数分泌胞外酶，然而霉菌却会既分泌胞外酶又分泌胞内酶。因角蛋白来源的不同，使得酶拥有不同的特性,以及其适宜底物也各不相同,部分
13、角蛋白酶水解能力较强，能水解多数蛋白质,而有些则只能水解角蛋白,不能酶解胰蛋白、牛血清白蛋白等15-16。已报道的多数角蛋白酶最适反应温度主要集中在30-75之间，多数为45-55，也有极少数的最适温度可以高达100，如Fervidobacterium islandicum分泌的角蛋白酶17-18。角蛋白酶的最适pH在酸性、中性和碱性均有分布，在41319之间，主要集中在7到10之间。角蛋白酶一般有着比较广泛底物范围，包括多种可溶性和不溶性蛋白质，如牛血清蛋白、酪蛋白、胶原蛋白和卵蛋白等20-21，一种角蛋白酶仅对单一底物有较高的降解能力22。1.2基因重排技术（Genome shufflin
14、g）1.2.1基因组重排技术原理基因组重排(Genome shuffling) 技术在近几年飞速发展起来，是一种极其高效的微生物育种方法。菌株诱变改良，再杂交育种，让不同的突变菌株的基因组能够充分重组，增加不同正向突变整合到一个重组子中的机会，从而大幅度提高了正变率，得到我们想要的表现型23-24。基因重排技术被Stephanopoulos认为是菌种选育上的里程碑25。亲本基因库在多位置发生交换和重组，大大的促进了正突变融合子的产生26。1.2.2 基因组重排技术方法Zhang等27于2002年在Nature上首次提出将基因重组技术结合传统育种技术，通过多亲本基因重组交换，得到优良表型。基因组
15、重排技术是一种新型的育种技术，它是建立在原生质体融合技术之上的，让不同基因组重排的过程28。基因组重排技术主要有三个步骤：1)亲本基因库的建立；2）原生质体递归融合；3）融合子的筛选。1.2.2.1亲本基因库的建立建立亲本基因库是基因重组技术的基础，以原始菌株为基础，通过不同手段得到更多基因型，收集目的性状的菌株，从而形成所需的亲本基因库。 亲本菌株的筛选一般是菌株必须具备理想目的表型，如耐高温、高产或高生长率等。亲本基因库的建立主要还是通过经典育种方法，诱变育种和直接筛选。采用组合的经典育种方法能够保证基因库的多样性，很大程度上丰富亲本基因组库。1.2.2.2原生质体递归融合原生质体融合技术
16、是基因组重拍技术的基础。随着科技的发展，细胞基因重组的手段有很多，然而原生质体融合因为具有高频率的基因转移和重组效率被广泛使用。但是多亲本的融合仍会发生较低的重组效率27，这个问题现在通过原生质体递归融合得到有效的解决。多轮递归融合确保了基因的高转移频率，基因组重排的高效性也得到了保持。原生质体的制备是递归融合的首要过程。不同微生物的细胞壁结构会有很大差别，随意在原生质体的制备中，主要需要考虑到菌株的最适菌龄、最佳酶解浓度、最佳酶解时间、最佳温度的选择，以及再生培养基的设计等。原生质体融合技术应用得最广泛的主要是化学助融和电处理融合法29。然而随着科技的不断发展，越来越多的新技术产生，提高了原
17、生质体融合的制备率和再生率。红发夫酵母使用激光诱导融合来提高融合率30，微流体芯片技术也被用作诱导细胞融合31，镭射光镊子也作为一种新新技术被应用于细胞工程32。 完整细胞酶解细胞壁原生质体PEG原生质体融合原生质体再生筛选融合子 图1-1 原生质体融合过程示意图 Fig. 1-1 The process of protoplast fusion1.2.2.3融合子的筛选融合子的筛选是整个基因组重排过程中最为关键的步骤。传统的菌株工程把基因多样性的产生和目的形状的筛选作为中心内容，基因多样性的方法已经有一些深入的研究，然而目的形状筛选方法仍然有待发展。对于融合子的筛选，目前主要还是采用对目的菌
18、产物的物理和化学性质分析判定。如John 等33利用能直接水解淀粉的乳酸融合菌在培养基上产生的透明圈的大小来筛选高产融合菌。近年来，灭活标记、抗药性标记、光谱学标记和其他标记等方法也被应用于融合子的筛选，为基因组重排技术提供了一个新的方向。1.2.3基因组重排技术的优点基因组重排技术，与经典育种相比，有其独特优势。（1）相比传统诱变选育更快更高效。传统诱变育种通常把每一轮的突变体中筛选出的最优的一株菌作为下一轮诱变的出发菌株，而基因组重排技术则是将一次诱变获得许多正突变菌株共同作为亲本菌株，经过递归多轮融合实现大范围内的基因重组，以更高更快的效率获得目的菌 34。（2）能提高子代菌株的遗传多样
19、性。基因组重排技术以原生质体融合技术为基础，但基因组重排技术在于使用多亲本，而不是像原生质体融合一样使用双亲本。进行多轮递归融合，能产生多样的突变组合，这将大大增加子代菌株的遗传多样性，提高了优良性状菌株的获得几率35-36。（3）该技术简单实用，容易推广。基因组重排技术对设备要求不高，费用较低，易于实施。对工业微生物基因的结构和功能了解不详细，没有工业微生物的代谢路线图及其代谢调控机制等理论也能进行该技术的使用 35-36，因此，普通的育种工作人员或者研究者在普通的一般实验室条件下就能开展相关实验。1.3 本论文研究的目的意义、思路设计及主要内容1.3.1 研究目的意义本论文研究的主要目的和
20、意义是：角蛋白酶以其特异性分解角蛋白的特性，在废弃羽毛的处理，清洁制革技术等领域中得到广泛应用。然而，角蛋白酶的工业生产还有很多问题等着我们去解决，酶活力不高也是其中之一。基因组重排技术是近年来兴起的高效的微生物育种技术，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，因此可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。它可以快速、高效的选育出表现型得到较大改进的杂交菌种，具有广泛的应用。通过基因重排技术筛选提高产角蛋白酶菌株产酶酶活力，有利于实现角蛋白酶的工业化生产。1.3.2 论文设计思路 本论文采用基因重排的技术方法，建立亲本基因组库，通过原生质体融合，得到融合子，并筛选高酶活力的融合子；
21、并通过单因素实验确定酶解最佳条件和融合最佳条件。具体流程如图1-2所示。图1-2 本论文设计流程Fig. 1-2 The design process of the thesis1.3.3 主要内容 本论文主要从以下几个方面对课题进行研究：（1）通过单因素实验确定Bacillus licheniformis X-47的最佳酶解条件和最佳融合条件；（2）利用基因重排技术筛选角蛋白酶活力高的菌株。第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1菌种 地衣芽孢杆菌，Bacillus licheniformis X-47，由本实验室分离与鉴定37。2.1.2药品与试剂干酪素，Sigma公司；葡萄糖，成都科
22、龙化工有限公司；牛肉膏，北京奥博星生物有限公司；L-天冬酰胺，上海博奥生物有限公司；溶菌酶，Lysozyme（Egg White），BIOSHARP；脱脂羊毛 ：将制革废羊毛反复清洗，加入1%脱脂剂以及1%脱脂酶脱脂12 h后乙醇浸泡一天，充分水洗后30 干燥，用剪刀将其剪到1 mm的碎段备用。Folin甲试剂： 溶液1，称取0.5 g CuSO45H2O和1.0 g Na3C6H5O7（H2O），溶解于100 mL去离子水；溶液2，称取20.00 gNa2CO3和4gNaOH，溶解于1 L去离子水；溶液1和溶液2以1 : 50的比例混合均匀。Folin乙试剂：称取100 g钨酸钠（NaWO2
23、2H2O）和25 g钼酸钠（Na2MOO4 2H2O）置2000 mL磨口回流装置内，加700 mL蒸馏水和100 mL浓盐酸。小火加热，回流10 h，再加入150 g硫酸锂（Li2SO4H2O），50 mL蒸馏水及数滴液溴。在通风橱中开口煮沸15 min，冷却后定容至1000 mL。然后1:1与去离子水混合均匀。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。聚乙二醇PEG溶液：PEG6000用高渗溶液配制；300 g/L PEG：3 g PEG6000溶解于10 ml SMM，pH9.0；400 g/L PEG： 4 g PEG6000溶解于10 mL SMM，pH7.0，pH8.0， pH9.0，pH10
24、.0，pH11.0；500 g/L PEG：5 g PEG6000溶解于10 mL SMM，pH9.0；0.06-0.07 MPa灭菌30 min；高渗溶液(SMM)： MgCl2 0.02 mol/L；顺丁烯二酸 0.02 mol/L；蔗糖 0.5 mol/L。以双蒸水配制，pH调至6.5，0.060.07 MPa灭菌30 min；溶菌酶溶液：使用前，称取一定量的溶菌酶用高渗溶液配置，使溶菌酶的浓度达到0.1 mg/mL ，1.0 mg/mL，2.0 mg/mL，3.0 mg/mL，并经过0.22 m的无菌过滤器过滤；新生磷酸钙：分别配置1 mol/L CaCl2溶液和0.02 mol/L
25、K2HPO4溶液， 0.060.07 MPa灭菌30 min，使用时等体积混合；其它试剂为分析纯。2.1.3培养基种子培养基(g/100 mL)：葡萄糖 1.5 g，K2HPO4 0.07 g，L-天冬酰胺 0.09 g，牛肉膏 0.07 g，NaCl 4 g ，pH 7.0。筛选培养基(g/100mL)：干酪素 0.6 g，牛肉膏 0.3g，蛋白胨 1g，NaCl 6 g，琼脂1.5 g，pH7.0保藏培养基(g/100mL)：牛肉膏 0.3g，蛋白胨 1g，NaC l6 g ，琼脂 1.5 g，pH7.0发酵培养基(g/100mL)：可溶性淀粉4 g，黄豆粉 0.327 g，K2HPO4
26、0.269 g，L-天冬酰胺0.13 g，NaCl 4 g，脱脂羊毛0.2 g， pH 7.0-7.2。2.1.4主要仪器设备Cover-015光学显微镜 OLYMPUS公司 日本；SW-CJ-2FD型净化工作台 苏州净化设备有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒实验仪器有限公司；HZS-H超级恒温水浴锅 哈尔滨市东联电子；GL-20G- II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；2112恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司；旋转蒸发水浴锅 上海亚荣生化仪器设备有限公司；TGL/16M冷冻离心机 长沙湘麓有限公司；722S型光光度仪 PE 美国；Sartorius分析天平 北京赛多利
27、斯天平公司；DHG-9070A型干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；2.2 实验方法2.2.1角蛋白酶活力分析方法采用Lowry法测定角蛋白酶活力。2.2.1.1酶活力标准曲线的绘制标准曲线的绘制见附录1。 2.2.1.2角蛋白酶活力测定加入4 mL 0.05 mol/L pH10.0 Gly-NaOH缓冲液和脱脂羊毛 0.02 g，再加入待测酶液1 ml。60 培养30 min，加入1 mL 20 %TCA溶液以终止反应，空白对照组在加入酶液同时加入1ml 20 %TCA溶液。然后室温静置60 min后过滤掉不溶物，吸取 1 mL上清液，采用Lowry法检测其蛋白质的含量。加入5 mL Fol
28、in甲试剂，混匀在室温下放置5-10 min；加入1:1稀释的0.5 mL Folin乙试剂，立即混匀后于25 条件下水浴25 min, 取出测定清液在波长750nm条件下的吸光度，然后与标准曲线对照测得角蛋白酶活力.角蛋白酶活力的定义：1 mL酶液每30 min释放1 g蛋白质（以牛血清为标准蛋白质进行折算）为一个活力单位（U）。2.2.2 原生质体的制备和再生将实验室保存的地衣芽孢杆菌，Bacillus licheniformis X-47接种到斜面培养基活化12 h，再接种到种子培养基，于温度37.0 ，转速180 rpm再次培养24 h，然后按6 %的接种量接种到种子培养基中培养至OD
29、值为0.8时停止，立即取下摇床， 5000 rpm下离心8 min，弃上清液。同样条件用生理盐水洗涤2次，高渗SMM溶液洗涤1次，最后用高渗SMM溶液等体积悬浮，制成的菌悬液，取适量菌液稀释进行活菌计数X。取适量高渗菌体悬浮液于小三角瓶中，加入溶菌酶酶解，水浴低速震荡。酶解后立即离心，弃去上清液，用高渗溶液洗涤一次，最后悬浮于等体积的高渗溶液中。其中，溶菌酶浓度设置为0.1 mg/mL，1.0 mg/mL，2.0 mg/mL,3.0 mg/mL；酶解时间设置为10min，20min，30min，60min，120min；酶解温度设置为25，30，35，40，50。用高渗溶液和生理盐水稀释进行活
30、菌计数。生理盐水为Y，高渗溶液为Z。原生质体形成率（%）原生质体再生率（%）X：处理前菌落数；Y：未被酶解的菌落数；Z：再生原生质体数和未被酶解的细菌数2.2.3原生质体的灭活将制备好的原生质体进行紫外灭活，其处理方式为菌液悬浮在平皿中于紫外灯下照射20 min。灭活处理后适当稀释，涂平板进行活菌计数，在37 培养箱培养，计算原生质体灭活率。2.2.4原生质体的融合及其条件优化取灭活后亲本原生质体1 mL液体，转速3800 rpm，离心20 min，去掉上清液，加入制备好的0.1 mL 新生磷酸钙溶液，混和均匀，再加入0.9 mL PEG 6000溶液，不同的温度下作用不同的时间，之后用高渗S
31、MM溶液将其稀释，3800 rpm，20 min离心，去掉上清液，再用高渗SMM溶液定容到1 mL，混和均匀后稀释涂布计数。其中，选择优化的融合温度为25 、30 、35 、40 和45 ，选择优化的融合时间为5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，选择优化的PEG浓度为300、400、500 g/L，选择优化的融合pH为7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。2.2.5融合子的检出首先在再生培养基平板上挑选四周拥有透明圈的菌落，接种到保存培养基斜面上。取得一定量的斜面后，进行融合子初筛：分别从斜面试管中挑取一环菌体接种于盛有50 mL发酵培养基的250 mL的
32、三角瓶中，置于恒温摇床中37 ，180 rpm条件下培养72h，然后将发酵液离心（4 ，10000 rpm）5 min，取上清液测定角蛋白酶活力。将初筛得到的产酶活力较高的菌株进行复筛。复筛过程与初筛相同。第三章 结果与讨论3.1最适菌龄的确定由于实验菌种长期保存，可能已经衰老退化，通过前期试验的观察，需要经过24小时复壮，然后把菌株接入种子培养基进行培养，得到地衣芽孢杆菌B. licheniformis X-47的生长曲线图2-1。从图2-1中看出，0-10小时为该菌的对数生长期，10小时左右进入稳定期。由于对数生长期的细菌细胞壁肽聚糖极少，对细胞壁的酶解更易发生，因此我们进行原生质体的制备
33、应该选取处于对数生长期的菌体。由图2-1可以确定B. licheniformis X-47的最适菌龄为9小时。图2-1 B. licheniformis X-47生长曲线Fig. 2-1 The growth curves of B. licheniformis X-473.2 酶解最佳条件的确定选择地衣芽孢杆菌B. licheniformis X-47为初始菌株，通过复壮培养，选择达到最适菌龄的菌体，通过溶菌酶酶解制备原生质体。通过溶菌酶酶解条件（本实验优化溶菌酶浓度、酶解时间和酶解温度）对原生质体形成率和再生率的影响，确定最佳的酶解条件。初始设置实验酶解浓度为1.0 mg/mL，酶解时间为
34、30 min，酶解温度为40 。3.2.1溶菌酶最佳浓度的确定从图2-2可以看出原生质体的形成率随着酶解浓度上升而不断增加，在酶液浓度0.1mg/mL到1.0 mg/mL的范围，形成率一直在增高，而到了1.0 mg/mL以后，继续增大酶液浓度，形成率反而有部分下降。原生质体再生率在酶液浓度0.1 mg/mL到3.0 mg/mL的范围内，整体处于下降趋势，随着酶液浓度增高而下降，在2 mg/mL时，再生率下降明显，之后几乎处于0%。整体来说，原生质体的形成率随酶液浓度上升而增加，而再生率却越来越低。在一定酶解时间和温度下，浓度过高的酶液会损坏细胞壁，导致其无法再生38。而且有报道称残留的细胞壁有
35、利于细胞壁的快速生成，有助于融合菌体细胞壁的生成39-40。因此，过高的酶液浓度虽然有利于原生质体的形成，却会导致细胞壁的再生收到阻碍，影响融合菌体细胞壁的再生。终上所述，结合图2-2不同酶浓度下原生质体形成率和再生率，选择酶液浓度为1.0mg/mL，原生质体形成率为96%，再生率为1.25%，使得原生体形成率较高，同时具有一定的再生能力。图2-2 酶解浓度对原生质体形成率和再生率的影响Fig. 2-2 Effect of lysozyme concentration on formation rate and regeneration rate3.2.2最佳酶解时间的确定如图2-3所示，在1
36、0到30分钟，原生质体的形成率上升明显，过了30分钟之后，形成率部分下降。而原生质体再生率随着时间的增加一直在下降，在30分钟时，下降明显。从图中看来，原生质体的形成并不是随着时间增加不断增加，在30分钟时，形成率处于最高。根据谭蓓英等的研究，保持部分残留细胞壁有利于细胞壁的快速生成。30分钟酶解时间下，原生质体形成率为94.5%，再生率为1.25%。一定酶解时间内，酶解的程度与酶解时间成正比，直到所有菌体被酶解为原生质体为止。过长的酶解时间，会导致原生质体融合后细胞壁难以生成，降低原生质体的再生率，增强酶液中杂质对菌体的作用；而过短的酶解时间，导致原生质体形成率过低，原生质体形成不完全。所以
37、，确定最佳的酶解时间为30分钟。图2-3 酶解时间对原生质体形成率和再生率的影响Fig. 2-3 Effect of lysozyme treated time on formation rate and regeneration rate3.2.3最佳酶解温度的确定从图2-4可以明显看出，酶解温度越高，同时原生质体形成率也越高，形成率和酶解温度成正比。在25 到35 ，原生质体形成率上升明显，35 以后处于平缓，温度到达50 时有略微下降。原生质体再生率随着酶解温度上升而下降，在35 到50 这段下降明显。在一定的酶液浓度和酶解时间下，提高酶解温度会使得酶作用更加活跃，提高酶促反应速率，增加
38、原生质体的形成率，当酶解温度超过酶的最佳温度以后，反而降低了酶活性，使酶解不充分，原生质体形成率下降。因此，在保证一定再生率的情况下，选择的最佳酶解温度为40 。图2-4 酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响Fig. 2-4 Effect of treated temperature on formation rate and regeneration rate 胡欣荣等41研究发现，酶解浓度对原生质体形成率影响最大，其次是酶解温度的影响，酶解时间影响最小。而对于再生率来说，酶解浓度影响最大，其次是酶解时间，酶解温度影响最低。由于菌株的特异性，导致原生质体的形成率和再生率影响因素不尽相同。有
39、报道称，由于外界条件的影响，即便是同一菌株原生质体形成率和再生率也不是相同的42-44。因此选择对数生长期的菌体来制备原生质体，并在酶解时保持一定的再生率，有助于原生质体的制备。根据上述实验分析可知，B. licheniformis X-47制备原生质体选择最佳菌龄为9 h，最佳酶解浓度为1.0 mg/mL，酶解时间为30 min，酶解温度40 。3.3 酶解后原生质体形成率、再生率和灭活率根据梁枝荣等45研究发现，以灭活原生质体进行融合，省去了复杂的遗传标记诱变筛选工作，避免了不良突变的发生，并在一定程度上提高了融合成功率；同时，还有能有效的区别融合子与亲本，大大提高了后期筛选的效率。原生质
40、体灭活有紫外灭活和热灭活两种方式，热灭活会对原生质体细胞质造成致死损伤，而紫外灭活则会对原生质体的DNA造成致死损伤，并且不同的原生质体在两种灭活方式下会有较大的差别46。灭活条件过于温和，灭活时间过短都会导致亲本存活过多，影响子代融合的筛选。根据李祥楷等47研究发现，灭活不彻底的原生质体，在进行融合时，亲本菌株可能会发生自融现象，对于子代融合子筛选造成不良影响。基于以上考虑，对于B. licheniformis X-47原生质体的灭活选取紫外灭活20分钟处理。表2-1原生质体酶解后形成率、再生率和灭活率Table 2-1 Formation rate, regeneration rate a
41、nd inactivation rate of protoplast after lysozyme treatmentStrainsFormation rate (%)Regeneration rate (%)Inactivationrate (%)Ultraviolet inactivated B. licheniformis X-4796.51.25100从表2-1看出，B. licheniformis X-47经过酶解后，原生质体形成率为96.5%，再生率为1.25%。原生质体在20分钟紫外灭活处理后，菌株的致死率为100%，将融合后亲本菌株在再生培养基上生长可能性将至最低。3.4 原生
42、质体融合条件的优化原生质体的融合是亲本菌株在脱壁形成原生质体后，在高渗环境下加入化学或物理助融因子，让亲本菌株原生质体相互融合，重组，再而重新长出细胞壁，获得融合子的过程48。本次实验选取的融合法是PEG融合法，通过PEG加入少量新生磷酸钙诱导原生质体的融合49。影响原生质体的融合因数有很多，本次实验主要对B. licheniformis X-47融合温度、作用时间、pH和PEG浓度进行研究确定。初始实验确定PEG6000浓度为400 g/L，pH为9.0。3.4.1原生质体融合最佳温度的确定如图2-5所示，25到35，原生质体的融合率显著提高，超过35 以后，融合率下降。适宜的温度有助于增加
43、细胞膜的流动，降低PEG粘度，提高原生质体的融合，而温度过高，影响到菌体本身而造成损失，降低融合率。因此，35时，原生质体的融合率最高，选取3 5为最佳融合温度。图2-5温度对原生质体融合的影响Fig. 2-5 Effect of temperature on protoplast fusion3.4.2原生质体融合最佳作用时间的确定图2-6融合时间对原生质体融合的影响Fig. 2-6 Effect of time on protoplast fusion如图2-6所示，不同的融合时间对原生质体的融合有着明显的影响。本次实验选取的5 min、10 min、15 min、20 min和2 5mi
44、n 共5个时间点，在5-15 min，融合率不断升高，超过15 min后，融合率不断下降，表明15 min后，PEG对细胞毒害作用显现，导致融合率的下降。选择15 min为最佳融合时间，原生质体的融合率最高。因此在融合完毕以后，应该迅速离心，之后以高渗溶液洗涤。3.4.3原生质体融合最佳PEG浓度的确定从图2-7可以明显看出，400 g/L浓度的PEG6000融合率高于300 g/L和400 g/L的浓度。PEG是一种特殊脱水剂，能够以分子桥形式存在于原生质体膜之间，改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，凝聚膜中的蛋白质，从而形成一层易于融合的无蛋白磷脂双分子层48。图2-7 PEG浓度对
45、原生质体融合的影响Fig. 2-7 Effect of PEG concentration on protoplast fusion过高的PEG浓度会导致原生质体中毒，过低会因为渗透压导致原生质体破裂。通常，使用的PEG分子量为1500-6000，融合的PEG浓度在30%-50%。在融合过程中，离子的影响也尤为明显，在融合过程中，加入Ca2+和Mg2+能够有效的诱导融合，特别是Ca2+被广泛应用于原生质体的融合。Ca2+的存在，能够改变原生质体表面的电子分布，使两个相互接触的原生质体局部融合，形成凹陷，构成原生质桥，大大促进了原生质融合的发生50。3.4.4原生质体融合最佳pH的确定如图2-8所示，不同的pH对原生质体融合的影响很大，pH为9.0时，融合率最高，过高或过低的pH都会导致融合率的下降。由于本次实验选取了Ca2+作为融合剂，根据有关文献得知，在Ca2+存在的情况下，碱性的融合环境能够有效的促进原生质桥的发生，进而增大融合几率，这是因为融合时不同的pH能够原生质体膜的电性状态，从而影响原生质体的融合。图2-8 pH对原生质体融合的影响Fig. 2-8 Effect of pH on protoplast fu