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1、酶工程概述,酶工程(Enzyme Engineering) 定义,研究酶的大量生产和应用的技术学科 食品酶工程,酶在工业上应用受到限制的原因 （1）不稳定、要求的条件不同； （2）分离纯化酶的技术繁琐、复杂； （3）酶制剂成本高，价格贵；,问题 1.增强酶的稳定性，拓展其用途 2.提高酶的产量，降低成本（活性、含量、分离手段改进）,7.1 酶的生产与发酵 7.2 酶的分离纯化 7.3 酶的固定化、酶传感器 7.4 酶分子的修饰与改造 7.5 酶的非水相催化 7.6 生物酶工程,7.1 酶的生产与发酵,利用微生物产酶优点,微生物种类繁多，菌种资源丰富； 微生物培养成本低廉； 微生物生长迅速，且菌
2、种易诱变,易于控制代谢方向； 采用发酵技术，易于工业化生产； 基因工程技术为微生物产酶提供了广阔的空间。,7.1.1 发酵生产酶的菌种,(1) 非致病菌，安全性好。 (2) 菌种较稳定，不易退化，不易感染噬菌体。 (3) 工艺简单易行，发酵周期短，产酶量高，能利用低廉原料。 (4) 酶的分离纯化容易，最好使用胞外酶菌种。,对于产酶菌种的要求,7.1.1.1 酶制剂生产的菌种来源,常用的微生物主要是细菌和真菌 枯草杆菌是生产淀粉酶、蛋白酶常用的菌种。 大肠杆菌是谷氨酸脱羧酶和天冬氨酸酶的生产菌种。 常用的真菌包括黑曲霉、根霉、米曲酶以及酵母。,7.1.1.2 酶制剂菌种的分离及培养,（1） 菌种
3、的采集与分离 （2） 菌种纯化 （3） 菌种的培养,7.1.2 酶的发酵生产,微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶 培养基 发酵条件 发酵方式,生长繁殖 产酶,7.1.2.1 酶生产发酵的营养需求,五大要素 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,7.1.2.2发酵条件及控制 生长繁殖 酶的形成,7.1.2.3 酶发酵生产的方式,根据细胞培养方式的不同，分为 固体发酵 液体发酵 固定化细胞发酵等,酶催化某一化学反应的能力。以单位时间底物的减少或生成物的增加来表示。 酶活力单位： 1 IU（international unit) = 1 mol/min 在特定
4、条件下（最适pH值、25、最适底物浓度、最适缓冲液的离子强度），1min内，能转化1mol底物所需要的酶量。,酶活力,酶活力大小,在实际中往往对不同的酶使用不同的酶活单位 -淀粉酶活力单位定义为:在60pH6.2条件下,每小时 可催化1g淀粉所需要的酶量为一个单位（U). 直接以光密度值表示：单位时间增加或减少0.001个光密 度值为一个酶活单位（U) ；例如溶菌酶、过氧化物酶,自定义酶活单位,指的是酶制剂催化能力的大小 既与酶蛋白的浓度有关 又与酶分子的催化能力大小有关。 在酶的研究和使用过程中，各酶制剂中的酶量一般用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即U/mg或U/mL。,酶量,
5、指的是每毫克蛋白所具有的酶量 表示酶的相对纯度，比活越高说明纯度越大 表示为U/mg.Pro,酶比活,7.2 酶的分离纯化 1 酶分离纯化的基本策略 2 酶分离纯化的方法 3 酶的剂型与保存,7.2.1 酶分离纯化的基本策略 酶分离纯化的基本过程 1 . 材料的选择与预处理 2 . 粗分离 3 . 细分离 4 . 制剂,酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩、干燥,酶的制剂,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心，过滤，沉淀，萃取，层析，电泳，萃取，结晶等分离技术,酶纯化方案的设计 完整的酶制备方案 酶活测定方法的建立 材料的选择 预处理对酶性质的初步探索 制定酶的纯化
6、程序 酶成品的保存,建立酶的活性测定方法 特异、灵敏、精确、快速、经济,分离纯化酶的三原则 1. 防止酶的变性失活 2. 目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去 3. 酶具有催化活性，检测酶活性，能跟踪酶的行踪。,防止酶变性失活的方法 1. 操作都应在低温条件下进行，尤其是在有机溶剂存在的情况下。 2.大多数酶在pH10的情况下不稳定， 故必须控制整个系统不要过酸过碱； 同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 3.酶常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性， 故操作中应尽量减少泡沫形成。 4.重金属等能引起酶失效， 有机溶剂能使酶变性, 微生物污染以及蛋白水解酶能使酶分解破坏。,酶分离纯化的
7、方法,对酶活性的初步探索 在制定纯化方法时应考虑该酶以下几方面： 分子量 等电点 稳定性（以pH、温度、变性剂、鳌合剂、巯基试剂等） 动力学常数（对底物、抑制剂、激活剂、辅助因子）。,利用酶的稳定性 1.确定纯化过程中保持酶活性应维持的条件； 2.若酶对极端温度、pH、有机溶剂或变性剂表现出不寻常的稳定性，则可利用这方面的性质，通过变性条件除去粗提液中大量的杂蛋白。,性质的精确数据 pI、分子量、Km、Ki、Ka等 应在获得纯酶后进一步测定以确认或校正 结构特征分析 结晶 X-晶体衍射技术 核磁共振 质谱 光谱 基因分析,制订酶的纯化程序 建立一个最有效的酶纯化程序，应考虑以下原则： （1）利
8、用酶在分离纯化上最有利的特性； （2）尽早使用一种选择性好的方法； （3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析； （4）不要连续使用相同的纯化方法，要使每步 过程的分辨能力呈递增趋势；,（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析； （6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法； （7）纯化过程中做三件事：量体积，测酶活力和测蛋白质浓度，监测纯化的进程。,7.2.2 粗酶液的制备 材料的选择 应具备酶含量丰富，材料易得，价廉等特点 采用代谢诱导的方法来提高生物材料中酶的含量 采用DNA重组技术得到酶含量丰富的工程菌株,预处理 动物或植物的器官组织、微生物作材料 例如 动物
9、材料要剔除结缔组织、脂肪组织； 油质种子最好先用乙醚等脱脂； 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； 微生物材料则应将菌体和发酵介质分离。 材料须尽可能以非常新鲜的状态直接应用， 否则就应将完整材料立即冰冻起来。,破细胞 酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况 1. 释放到细胞膜外的酶，叫胞外酶； 2. 游离化细胞内的酶，叫溶酶； 3. 牢固与膜或细胞颗粒结合在一起的，叫结酶 后两者合称胞内酶。,细胞破碎的方法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法,酶的抽提 是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料， 使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称酶的提取。,7.2.3 酶分离纯化过程的评价 在酶
10、的抽提和纯化过程中，为了了解所选择的方法和 条件是否适宜，每一步骤前后都应进行酶的活力测定， 作出总活力与比活力的比较。 酶的分离纯化过程中必须做三件事： 1 . 测定酶活力（IU/mL）； 2 . 测定蛋白质含量(mg/mL)； 3 . 测量体积(mL)。 活力回收（亦称为回收率或产率） 纯化倍数（亦称比活力提高倍数）,y(回收率) =,原料的总活力,某步骤后的总活力,e(纯度提高) =,原料的比活力,某步骤后的比活力,100%,100%,纯化方法与条件的比较标准 计算公式,在酶的纯化过程中，将各个步骤的测定结果 列成“分离纯化表”以便进行总结、检查和改进。,番麻蛋白酶分离纯化表,L.bre
11、vis的醇脱氢酶分离纯化表,Thermoanaerobium菌株JW/SL-YS489的木糖异构酶的纯化表,纯度的鉴定 纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。 但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。 酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法: （1) 溶解度法 （2）电泳法 （3）超离心法 （4）免疫学法,7.4 酶的剂型与保存 为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，酶制剂常以四种剂型供应： 1.液体酶制剂 2.固体粗酶制剂 3.纯酶制剂 4.固定化酶制剂,7.4.3提高酶的稳定性 提高酶的稳定性，延长保存期 影响酶的稳定性有以下几种因素 (1
12、)温度 (2)pH和缓冲液 (3)酶蛋白浓度 (4)氧 (5)防止微生物污染,稳定剂： 底物抑制剂和辅酶可使酶蛋白由不稳定的 扭曲状态转入稳定状态； B. 对含有巯基的酶，可加入SH-保护剂， 如巯基乙醇，谷胱甘肽，DTT等。,Ca2+能保护-淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl-能稳定透明质酸酶等 有时为了防止微生物污染酶制剂，加入一定浓度的甲醇，苯甲酸和百里酚等。,7.5 酶的固定化,酶应用中存在的一些不足,1、酶的稳定性较差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活； 2、酶:在反应系统中与底物和产物混在一起，难于回收利用。 3、产物：酶反应后的杂质与产物混合在一起，给分离
13、纯化带来一定的困难。,1、同一批固定化酶能重复多次使用； 2、酶和反应物分开，能较好地控制生产过程； 3、酶三级结构得到稳定，再加上抗干扰因素的存在，使酶的稳定性显著提高； 4、产物中不含酶，省去了热处理使酶失活步骤，有助于提高食品质量； 5、酶可长期使用，并可预测其衰变的速度； 6、提供了研究酶动力学的良好模型。,固定化酶的优点,7.5.2 酶的固定化方法,按照用于结合的化学反应的类型分为：,结晶法 分散法 物理吸附法 离子吸附法,微囊法 凝胶包埋法,共价结合法 交联法,非共价结合法 包埋法 化学结合法,酶的构象的改变； 载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍； 底物和酶的作用受
14、其扩散速率的限制。 在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。,（1）酶活力的变化,酶活力低于天然酶,7.5.3 固定化酶（细胞）的性质,酶稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对pH的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。固定化酶稳定性提高的原因可能是由于固定化后酶与载体多点连接或酶分子间的交联，防止了酶分子的伸展变形同时也抑制了自降解反应。,（2） 酶稳定性提高,（3） 最适pH值和最适温度的变化,酶固定化后，催化底物的最适pH值和pH活性曲线常发生变化，其原因是微环境表面电荷的影响。 酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果。在一般情况下，固定
15、化后的酶失活速度下降，所以最适温度也随之提高。, 酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小； 而当底物与具有带相反电荷的载体结合后，表 观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用是有利的。 此外，动力学常数的变化还受溶液中离子强度的影响，但在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。,（4） 动力学常数的变化, 影响相对酶活力的因素：载体结构、颗粒大小、底物分子量大小、酶的结合效率。 相对酶活力低于75的固定化酶，一般没有实际应用价值。,1、相对酶活力,具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值。,7.5.4 固定化酶（细胞）的指标,固定化酶的总活力与用于固定
16、化的酶的总活力之百分比称为酶的活力回收率。,2、酶的活力回收率,固定化酶的活力下降到为初始活力一半所经历的时间，用t1/2表示，它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。,3、固定化酶的半衰期,7.5.5 固定化酶的应用,1.固定化酶在乳制品中的应用 2.固定化酶在啤酒生产中的应用 3.固定化酶在果汁生产中的应用 4.固定化酶在柑橘类果汁脱苦中的应用 5.固定化酶在淀粉和糖工业中的应用 6.固定化酶在油脂改性中的应用 7.在天冬氨酸和苹果酸生产中的应用 8.在食品添加剂和调味剂生产中的应用,-以酶 为催化剂进行反应所需要的设备,7.5.6 酶反应器,搅拌罐型: 间歇式 连续式 多级连续式; 固定床(填
17、充床)型: 带循环式 列管式 流化床型 膜式: 平板状 螺旋卷型 转盘式 空心管式,酶反应器的类型,利用酶的催化作用将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通过换能器将反应过程中化学物质的变化转变为电信号记录下来，进而推出相应的生物分子浓度。 酶传感器是间接型传感器，它不是直接测定待测物质，而是通过对反应有关物质的浓度测定来推断底物的浓度。 目前国际上已研制成功的酶传感器有20余种，其中最为成熟的传感器是葡萄糖传感器。,酶传感器,酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。用于样品组分的分析检测，有快速、方便、灵敏、精确的特点。 所用的酶必须具有较强的专一性，并且要有一定的纯
18、度。固定化方法一般采用凝胶包埋法制成强度较高、通透性较好、厚度较小的酶膜，并将它与适宜的电极紧密结合。,酶电极是应用最广泛的一种酶传感器, 酶细胞稳定性，不适合大量生产的需要； 酶的最适pH中性，工业应用的pH值要求不一，使酶难于发挥作用； 在临床应用上，绝大多数酶对人体而言属于外 源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。, 酶在应用上暴露出来的一些缺点,7.7 酶分子的改造,(1) 通过分子修饰的方法来改变已分离出 来的天然酶的结构 (2) 通过生物工程方法改造编码酶分子的 基因从而达到改造酶的目的,改变酶特性的两种主要途径,通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，以
19、改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用，以达到较高的经济效益。,酶分子的化学修饰,1、提高酶活力； 2、改进酶的稳定性； 3、允许酶在一个变化的环境中起作用； 4、改变最适pH值或温度； 5、改变酶的特异性使它能催化不同底物的转化； 6、改变催化反应类型； 7、提高过程的反应效率。,制备修饰酶的目标,7.7.1 酶分子修饰的方法,7.7.1.1 酶的表面化学修饰（大分子修饰、小分子修饰、交联修饰、固定化修饰 ） 7.7.1.2 酶分子内部修饰（非催化活性基团的修饰、酶蛋白主链的修饰催化活性基团的修饰、伸展后肽链的修饰 ）,使酶与其它大分子结合，形成复合物，就可起到保护
20、酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳定性。, 酶活力提高,使酶活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶活。, 酶的稳定性增加,7.7.1.3 酶分子修饰后的性质,当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质，这些物质称为抗体，能引起体内产生抗体的物质称为抗原，如精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性。, 酶的抗原性消除或降低,生物酶工程主要包括： 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）； 修饰酶基因，产生遗传修饰（突变酶）； 设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶（新酶）。 目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。,7.8 生物酶工程,