《Simon自动化蛋白表达分析系统培训手册.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Simon自动化蛋白表达分析系统培训手册.pdf（19页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、WesTM全自动蛋白表达分析系统 简明用户手册 普诺森生物科技（上海）有限公司 Revision 3.3, Dec 2016 目录 1. 准备样品和抗体 . 3 2. 准备Wes 4 3. 加样 . 5 4. 上机操作 . 8 5. 运行状态和实验结束 . 9 6. 数据分析 . 10 7. 注意事项 . 16 8. 常见问题 . 17 9. 订购信息 . 18 1. 准备样品和抗体 1) 样品的制备方法与传统 Western 相同 样品保存在裂解液（ Lysis Buffer）中 某些裂解液成分可能会对实验结果有影响 建议查阅 Simple Western Buffer Compatibil
2、ity.pdf 不要加入 Western上样缓冲液（ Loading buffer ） 2) 通过 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度 浓度建议在 3 g/ L 或以上，如果靶蛋白丰度低（如磷酸化蛋 白），推荐上样终浓度 2 g/ L，其他靶蛋白可选择 0.5 g/ L 如果裂解液中含有 SDS ，样品可用 0.1 Sample Buffer 稀释 ProteinSimple 提供10 Sample Buffer，需要取出部分用去离子 水稀释成 相应浓度后使用 10 Sample Buffer 可以单独订购，货号为 042-195 如果样品裂解时不含 SDS （如在 PBS 缓冲液中超声破碎），样品
3、需 用1 Sample Buffer 稀释以保证有足量的 SDS 与蛋白质结合 3) 测定浓度后，样品可分装冻存在- 80 冰箱直到使用时取出 4) 一抗稀释方法 使用 ProteinSimple 提供的 Antibody Diluent II 稀释后使用 建议购买 Wes 验证过的抗体，货号和稀释度可查询抗体数据库： http:/ 如果您使用的一抗不在抗体数据库里，建议比抗体说明书 （datasheet）里推荐的 Western 浓度高 10 20 倍，即抗体说明书 推荐1:1000，Wes 则用1:50 - 1:100 的稀释度 5) 二抗 目前 ProteinSimple 提供的商品化二
4、抗有羊抗小鼠和羊抗兔，您不 需要准备这两种二抗 如果您的一抗种属来源不是小鼠和兔，建议您搜索抗体数据库， 购买相应的二抗，用 ProteinSimple 提供的 Antibody Diluent II 稀释 后使用 如果您使用的二抗不在抗体数据库里，请您与我们的技术支持联 系 2. 准备Wes 1) 实验室的温度确保在 18 24 之间，湿度在 20 60 % 之间。如果温 度、湿度未达到要求，请打开空调、除湿机或其他相关设备，直到 达到要求再开始实验。 2) 依次打开 Wes、电脑和 Compass 软件。 如果电脑连接上 Wes，会显示 如果电脑没有连接上 Wes，请点击 Instrume
5、nt Connect 3) 进行硬件自检。 点击 Instrument Self Test 进行 Wes 硬件自检，时间大约需要 10 分钟 我们建议您在使用前执行自检，以排除任何潜在的硬件问题 3. 加样 1) 请根据试剂盒内附的说明书要求进行操作 2) 下面以 SM-W004和DM-001为例，介绍实验的具体过程： a) 准备冰盒和碎冰，取出存放在 4 的两个透明塑料盒（ PS-ST01-8 和DM-001），将其中的试剂冰上放置； b) 打开一包 白纸包（ Standard Pack 1 ），取出里面 4 根管子； c) 将所有 0.2mL 管的铝箔撕开或用手拿着枪头戳个洞； d) 配制
6、 DTT ：透明管内有白色 DTT 粉末，加入 40 L 去离子水，吹打 均匀； e) 配制 5 Master Mix（即Loading Buffer）：透明管内有粉色 Master Mix 粉末，加入 20 L DTT 溶液（上一步配的，如果想进行非还原 电泳，可以水代替 DTT），20 L 10 Sample Buffer（在橙色试剂盒 内），吹打均匀； f)配制 Ladder （即marker，分子量标准品）：白色管内有粉色 Ladder粉末，加入 16 L离子水， 2 L DTT 溶液（Ladder一定要加 入DTT ，否则分子量会变化），2 L 10 Sample Buffer，吹打
7、均 匀，吸出 10 L左右放到空的 0.6mL 管内待变性； g) 配制样品： 1 个孔需要 3 L样品（加入了 Master Mix的），为了防止变性时 的蒸发，建议 1 个孔配 1.5 个孔的量，假设样品浓度为y，以下 为配制1个孔所需要的体积： 终浓度 （ g/ L） 样品原液 （L ） 5 Master Mix（L ） 0.1 Sample Buffer （L ） 总体积 （L ） 0.2 0.2 4.5/ y 0.9 4.5 (0.2 4.5/ y) 0.9 4.5 1 1 4.5/ y 0.9 4.5 (1 4.5/ y) 0.9 4.5 将配制好的 Ladder 和样品一起放在
8、95 变性 5 分钟； 变性结束后将 Ladder和样品取出，冰上冷却 5 分钟。冷却后涡 旋振荡混匀，再短暂离心，放在冰上待用； h) 配制一抗：一抗用 Antibody Diluent II 稀释后放在冰上待用； 每孔需要 10 L稀释后的一抗，根据总数适当放量 1-2 个孔 i)二抗即开即用无需配制； j)配制发光液： Lumino-S 和 Peroxide 各取 200 L，涡旋振荡混合， 放在冰上待用； k) 从橙色试剂盒里取出板子，将配制好的试剂依次加入板内： 注意！加样时可用反相吸液法，即第二档吸，第一档打，这样 可以留少量液体在枪头中，以避免将枪头中的空气吹入液体内 形成气泡。
9、 A 行：A1 为 Ladder，5 L ，其余孔为样品，体积 3 L B 行：Antibody Diluent II （抗体稀释液），体积 10 L C 行：C1 为Antibody Diluent II ，其余孔为稀释的一抗，体积 10 L D 行：D1为Streptavidin-HRP，其余孔为相应的二抗，体积 10 L E 行：发光液，体积 15 L F 行：空 紧邻 F 行的三大行内每格加入 500 L Wash Buffer（Wash Buffer 在 橙色试剂盒内） l)盖上盖子，配平后在室温 2500 rpm （ 1000 g）离心 5 分钟； 注意！一定要加盖子 注意！离心机
10、不能制冷 离心后检查并确认孔底无气泡 4. 上机操作 1) 双击打开 Compass for SW ，在点击 File New Assay ； 2) 在弹出的新窗口中选择相应的程序，点击 OK 加载； 默认程序的参数已经过优化（推荐） Western 的Assay Type 为 Size 根据板上标注的分子量范围选择 Size Range 根据毛细管包装上标注的数目选择 Cartridge 3) 轻轻触碰 Wes 门上部的银色区域，打开门； 4) 撕开毛细管的包装，取出毛细管放入 Wes； 注意！请从黑色基座两侧拿取，不要直接接触毛细管 5) 将离心后的板子取出，一手按住板子，一手撕去封膜，将
11、板子放入 Wes； 6) 关门，稍等 5 秒钟等门锁止，点击 Start 开始运行； 7) 弹出的对话框内可选择文件的存储位置，默认路径： 我的文档 CompassRuns文件夹内。 5. 运行状态和实验结束 1) 开始运行以后， Compass 软件会自动进入 Run Summary 界面，并显示 实验的步骤和时间 开始运行后 10 分钟可以看到蛋白质进入毛细管内； 无需等待实验结束，结果可第二天再来看 2) 实验结束后，轻触开门，将毛细管和板子取出丢弃； 3) 依次关闭 Compass 软件和电脑。 如果在一周内还要使用 Wes，Wes 可以不关机 6. 数据分析 1) 板型布局： 如果实
12、验开始前没有来得及设定布局，请在实验结束后设定； 点击进入 Assay界面，在 Template里面双击任意孔会弹出新窗口， Name 填入名称， Attribute 填入终浓度，可以利用 ctrl+c 和 ctrl+v 进行孔复制粘贴，也可以利用 shift 和 ctrl 连续选择多个孔进行填 充，甚至可以从 Excel 复制过来粘贴； 2) 检查荧光内参： 荧光内参是校正毛细管与毛细管之间电泳迁移率差异，如果荧光 内参定位错误，会影响靶蛋白的分子量计算 每根毛细管内含有 1kD，29kD 和 230kD 这三个荧光内参 进入 Run Summary 界面，在 Separation 里检查每
13、根毛细管内是否 含有三个荧光内参； 随后切换到 Analysis 界面，选择 Standards Single View Graph ， 检查每一根毛细管里荧光内参定位是否正确。荧光内参在Graph里 被标注为 Std 1, Std 29 和 Std 230 如果出现定位错误，在正确的峰上点击鼠标右键调出菜单，然后 选择 Force Standard 来校正，如果校正出错，可选择 Clear All 恢复 默认设置； 小贴士： 1kD 的荧光内参通常信号最强 3) 检查Ladder： 选择 Samples Ladder ，检查 Ladder 的 6 个峰（12kD, 40kD, 66kD, 1
14、16kD, 180kD和230kD）的分子量是否正确，正常谱图如下所示： 如果 Ladder 分子量不正确，则不能利用Ladder来计算分子量，可 以在 Edit Analysis. Standards Ladder Capillary 里面设成 None，这样软件就不会通过 Ladder计算分子量，而是依靠每根毛 细管内的荧光内参来计算分子量； 4) 检查样品： 完成上述步骤后才可以查看样品的结果； 注意在 Edit Analysis. Images 里选择不同曝光时间，同时查看靶 蛋白的 S/N 值（S/N 值越大越好） 5) 数据和图片导出： 在Edit Analysis. Peak N
15、ames 里面设定靶蛋白的分子量（需要根 据Wes上跑出来的分子量设定） Apply To 这里有下拉箭头，只要您在Assay 里面命名了一抗的名 称，这里会有相应的选择出现，您可以将设定的靶蛋白分子量应 用到加了该靶蛋白一抗的孔上 6) 点击 OK 保存设置并退出。样品中靶蛋白的名字将会自动标注在Graph 里。这时候您点击 Capillaries，这里将会显示您靶蛋白的条带密度值 （Area），您可以利用 Ctrl+A 将 Capillaries 里的数值全部选中，然后 复制粘帖在 Excel 。 7) 点击 Lane 进入模拟胶图界面，可以点击 View All 全部选中； 8) 也可以
16、点击 Single View，然后利用 Ctrl 键选择您想要的某几个泳道； 9) 右上角的 Contrast Adjustment可以调整图像对比度； 如果您想精确调节对比度，可以进入EditAnalysisLane Contrast，选择Fixed Levels，输入 White Level和Black Level 的值。 10)右上角的 Edit Labels，可以显示 /隐藏图片上方的文字标注； 11)图片调整好以后，在图片上点击鼠标右键，出现Copy，选中Copy， 出现新窗口，选择相应的保存格式，点击Save 可将图片另存在您指 定的地方。 注意事项 1) 试剂盒务必请按要求存放，
17、橙色试剂盒要保存在18 24 ，如果不小 心冷藏或冬季室温过低，需要在18 24 放置 24 小时后才能使用， 否则电泳会出现异常； 2) Ladder 务必和样品一起变性； 3) 加样时避免打出气泡，尤其样品中的气泡很难戳破； 4) 如果加样过程中要暂停，请务必盖上板盖，以减少蒸发； 5) 加样后务必盖上板盖，才能去离心； 6) 加完样板子务必离心； 7) 板式离心机请勿制冷； 8) 毛细管和板上的封膜都在实验即将开始前才打开，请勿提前打开； 9) 毛细管和板子都是一次性的，请勿重复使用； 10)更多实验优化，参见 Size Assay Development Guide.pdf； 11)使
18、用2-40kD试剂盒， Compass软件必须升级到 v3.0版本或以上； 12)Compass软件不限制安装，最新版可从网站下载： http:/ 13)如果您有任何问题，可联系我们的技术支持，或拨打 4000-863-973。 7. 常见问题 现象可能原因解决方法 3个荧光内参全部弥散无 法辨认 Wes 板 子 没 有 在 室 温 保 存，造成试剂成分沉淀析 出 Wes 板子需要在实验开始 前室温（ 18 24 ）放置 至少24小时以上 荧光内参分离谱图与预期 不符 使用了错误的荧光内参 请 核 对 白 色 纸 包 上 的 标 记， Standard Pack 1为12- 230kD，Sta
19、ndard Pack 2为 66-440kD 荧光内参跑出了毛细管 板子上机前没有离心。板 子在运输过程中或者上样 时有气泡 上机前室温离心，确保各 孔内无气泡。如果再离心 后看到有气泡，请用枪头 将其戳破 荧光内参进入了毛细管， 但是没有进一步分离 Wes 板 子 被 冷 藏 或 冷 冻 过，造成试剂成分析出 Wes 板子需要在实验开始 前室温（ 18 24 ）放置 至少24小时以上 Graph View 发现靶蛋白分 子量位置有凹坑 化学发光信号淬灭 选择短的曝光时间（例如 5s）查看结果。可减少样 品浓度 化学发光信号与蛋白量不 成线性 不在检测的线性范围内 通过样品梯度稀释确定实 验的
20、检测上限和下限 化学发光信号重复性差抗体不够量 通过抗体梯度稀释确定最 佳的抗体稀释度 Total Protein 试 剂盒 批次 内重复性差 Biotin Labeling Reagent 没 有充分重悬 Biotin L abeling Reagent 不 是新鲜制备 Reconstitution Agent 1 和 Reconstitution Agent 2 混 合后上下吸打 6 10 次， 保证充分混匀 在上机前30 分钟内制备 Biotin Labeling Reagent 8. 订购信息 项目订货号 Anti-Rabbit Detection Module for Wes, Pe
21、ggy Sue or Sally Sue DM-001 Anti-Mouse Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue DM-002 No secondary Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue DM-003 Total Protein Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue DM-TP01 12-230kDa Wes Separation Module 8x25 capillary cartridges SM-W004
22、 12-230kDa Wes Separation Module 8x13 capillary cartridges SM-W002 66-440kDa Wes Separation Module 8x25 capillary cartridges SM-W008 66-440kDa Wes Separation Module 8x13 capillary cartridges SM-W006 2-40kDa Wes Separation Module 8x25 capillary cartridges SM-W012 2-40kDa Wes Separation Module 8x13 ca
23、pillary cartridges SM-W010 Wes 12-230 kDa Total Protein Master Kit with Split Buffer for 104 data points PS-TP09 Fluorescent 5XMaster Mix 1 (12-230kD) PS-FL01-8 Fluorescent 5XMaster Mix 3 (66-440kD) PS-FL03-8 Fluorescent 5XMaster Mix 5 (2-40kD) PS-FL05-8 10System Control Primary Antibody - Rabbit 04
24、2-196 10System Control Primary Antibody - Mouse 042-191 Streptavidin - HRP 042-414 Chemiluminescent Substrate PS-CS01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 20X Anti-rabbit HRP Conjugate 043-426 NP1000 超微量蛋白修饰谱图研究平台 主要功能： 利用靶蛋白各修饰体（如磷酸化）的电荷差异进行分离， 后续通过靶蛋白泛抗体即可获得
25、靶蛋白的修饰谱图，有 助于发现靶蛋白的新异构体或表征某类异构体的丰度 （如磷酸化百分含量等），从而阐明信号转导通路和调 控机理。 独有技术优势 1.可以对微量样本进行分析： 本平台是目前唯一可用于超微量样品检测的蛋白质研究平台。可检测样本包括： 激光捕获显微切割（ LCM）样本 体外培养的细胞 原代细胞 干细胞（肿瘤干细胞、胚胎干细胞） 外周血单个核细胞 无细胞体液（脑脊液、血清等） 流式细胞仪分选细胞 2. 可以有效区别蛋白质表达的异构体，翻译及后修饰等，并进行定量分析： 如检测蛋白质磷酸化、糖基化、乙酰化等修饰，用于揭示疾病发生的机理或寻找 新的生物标志物以及信号通路研究等。应用领域包括： 细胞信号通路研究 细胞死亡和凋亡通路研究 细胞耐药性：如激酶抑制因子的药效研究 分子靶向药物的作用机理研究 生物标志物的发现和验证：如肿瘤和神经退行性疾病的特异性生物标志物 干细胞研究：如造血干细胞和胚胎干细胞的分化 蛋白质纯度分析：如单克隆抗体纯度分析 蛋白质翻译后修饰和异构体、差异表达研究 3. 完整的靶蛋白修饰谱图： 本平台可用靶蛋白的泛抗体来检测靶蛋白质的电荷异构体，而无需使用针对各种 异构体的特异性抗体（如磷酸化位点特异性抗体），极大增强实验的灵活性以及 降低实验成本。