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1、TCDCANa 的合成及抗茵抗炎作用研究 作者 工作单位 摘要 ： 以鹅去氧胆酸( CDCA) 和牛磺酸为基本原料合成了牛磺鹅去氧胆酸钠(TCDANa ) ， 以萃取和重结 品法提纯 ,收率为 6 3 . 4 ， ( T C D C A N a ) 9 2 % , T LC和 I R 法确定了其结构。并将牛磺 鹅去氧胆酸钠与鹅去氧胆酸钠( CDCANa ) 进行了抗菌、抗炎和镇咳对比实验。药效实验结果为:TCDCANa 和 CDCANa 均具有抗革兰阳性菌作用 ( 抑菌环直径分别为 2 .46 0.08 cm 和 1.91 0.13 cm ) ,抗炎作 用抑制率分别为( 79.1 25.4)
2、和 (71.2 23.1 ) ，镇咳作川减咳率分别为(29.1 5.6 ) 和 (18.2 6.8 ) ， 牛磺鹅去氧胆酸钠与鹅去氧胆酸钠存在显著性差异。药效文验表明，TCDCANa 具明显的 镇咳、平喘和抗菌作用, 作用慢于CDCANa 。 关键词 ：牛磺鹅去氧胆酸；抗菌；抗炎；中药现代化 前言 牛磺鹅去氧胆酸 TCDCA ，2- 3 ， 7-dihydroxy-24-oxo-5cholan-24-y1)aminoethanesulfonic acid是鸡、鸭、鹅等动 物胆汁的主要有效成分之一，其质量占鸡胆汁中胆汁酸的 8 0 ，也是蛇胆的主要胆汁酸 1-3 成分之一。它是由鹅去氧胆酸 (
3、C D C A， 3 - 7- dihydroxy- 5- cholan- 2，4- oicacid) 的羧基与牛磺酸 (taurine，2 aminoethanesulfonic acid ) 的氨基以酰胺键相连而成的一 种结合型胆汁酸 ( conjugated bile acids) 。据文献报道 1,3-5 ， 新鲜的动物胆汁中几乎不含 游离型胆汁酸，但是由于肝胆疾病或贮存方法不当也可引起TCDCA 分解为游离型的 CDCA 。它 们均具有一定的抑菌、抗炎、镇咳等作用，在传统医学上，鸡胆汁用于治疗呼吸系统疾病，如 小儿百日咳、气管炎、肺炎等，而且疗效确切。 由于 T C D C A N
4、a亲水性强，不易从胆汁巾分离提取，要得到高纯度产品，以往只能 用硅胶柱层析法， 该法只适用于实验室制备少量高纯度样品，难以实现工业化生产。 为此， 我 们用化学合成的方法制备了TCDCANa，以萃取和重结晶相结合的方法，未经硅胶柱层析即可得 到纯度较高的产品，并以TLC及 IR 法对其结构进行了表征 , 探讨了 TCDCANa 的抗菌、抗炎和 镇咳作用。 2 2 1 材料与方法 1.1 实验用品 1.1 试剂及药品： 鹅去氧胆酸 ( 粗品) 、 可待因注射剂 ( 1 5 g L ) 、 磷钼酸、氨茶碱注射剂 ( 100 g L ) 、 乙酰胆碱磷酸可待因、牛磺鹅去氧胆酸钠（对照品） 、无水乙醇
5、、甲醇、乙酸乙酯、石油醚( 3 06 0) 、 氯甲酸乙酯、正三丁胺、氢氧化钠、碳酸氢钠均、牛磺酸、盐酸、硅胶 G 、 金黄色葡萄球菌标准株和大肠埃细菌标准株、NaOH 、盐酸、 NaHCO 3、 NaCl 、乙醚、丙酮、小 白鼠 1.1.2 仪器 FTIR 红外光谱仪 ( Spectrum One ，Perking Elmer Co ，America ) ，KBr 压片机 、二 道生理记录仪、蒸馏烧瓶、烧杯、电炉、铁架台、铁圈、天平、量筒、PH计、水浴锅、干燥 箱、玻璃棒、抽滤器、打耳器 2 实验方法及过程 2.1 TCDCANa的合成和精制 8-10 2.1.1 TCDCANa的合成 将
6、5.0g( 0.0127 mol)CDCA溶于 60 mL THF中，加入 3.0 m L 正三丁胺，搅拌使其充分 溶解， 在 0 滴入 1.65 mL 氯甲酸乙酯，搅拌15 min，缓慢加入含 1.75g (0.014 mol ) 牛 磺酸的 NaOH 水溶液，控制滴加速度，防止反应过于剧烈而冲料，15 min 内加完。然后，在室 温下继续搅拌 6h，溶液依次用 1 molL 盐酸， 饱和 NaHCO3水溶液洗涤，最后用饱和 NaCl 水溶液洗至 pH=8 ，过滤，洗涤沉淀，收集滤液，减压蒸馏至糖浆状，得黄色TCDCANa 浓缩液。 2.1.2 TCDCANa的精制 浓缩液先每次用 16mL
7、 乙酸乙酯充分搅拌混匀后，用分液漏斗分离，共进行3 次，酯层供 回收乙酸乙酯用。然后，向水层乙酸乙酯中滴加浓盐酸约0.5 m L ，至 p H= 5 6 为止。加 入 16mL乙酸乙酯，强烈搅拌10min 后收集滤液，分出水层，再用16 m L 乙酸乙酯萃取两次， 收集水层装入 250ml 烧瓶中减压蒸干。将干燥物用32mL无水乙醇溶解，置于8 5 水浴中加 热，使呈轻微回流状态，并保持15min 左右，撤去热源，稍冷后过滤，分别收集不溶物( 主要 是牛磺酸 ) 和滤液。向滤液中加入其体积1.5 倍的乙酸乙酯，允分搅拌后密封，置冰箱中冷却 3 3 1 到 2 小时，抽滤，收集沉淀，用冷乙醚洗涤
8、 2 次( 每次用 5 m L 左右) ，抽干将全部沉淀溶 于 14 mL C (NaOH)=0.2 mol L 的甲醇溶液，室温下搅拌 1 0m i n，若有不溶物过滤除去， 溶液减压 (4 5) 回收 4 6 mL 甲醇，将浓缩液冷却片刻，加入浓缩液 3 倍体积的乙醚， 搅匀后用塑料薄膜密封， 置冰箱中 (一 5 )静置过夜。 第二天抽滤， 收集沉淀， 抽干再用 8 mL 冷乙醚分 2 次洗涤，抽干，将沉淀置 100m L 烧杯中，加入 10 mL 【V(丙酮)：V（乙醚） =2： 1】的混合溶液充分搅拌后，过滤抽干，置真空干燥器中减压干燥 2 d ，再移至真空干燥箱 中（ 4 5) 干燥
9、至近于恒重即可。用薄层硅胶色谱( TLC ) 检测【V( 氯仿) ：V ( 甲醇) ： V ( 水)=65：28：4】 ，除主斑点外， 无其他可见斑点， ( TCDCANa) 92。得 TCDCANa 4.2g ， 收率 63.4 。 2.2 TLC 检查 硅胶 G吸附剂，以质量浓度为 1 gL 的样品的甲醇液点样5 微克，以【 V ( 氯仿) ： V ( 甲醇) ： V ( 水)= 6 5 ： 2 8 ： 4 】的混合液为展开剂，展开l5cm， ( 磷钼酸 )=5 的乙醇液为显色剂，于110 显色 10min 。 2.3 TCDCANa的药效作用 1.11 TCDCANa 用上法合成精制，所
10、得产品 ( TCDCANa ) 92。 实验动物为小白鼠 ( 昆明种 ) ， 体重 1822 g ，雌雄兼用，饲养室温度 ( 2 5 2 ) ，按性别分笼，自由饮水、进食。统计 学方法采用 t 检验分析。 2.4 体外抗菌作用 2.4.1 茵液制备 分别取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌接种于L B培养基中， 3 7 振荡培养 6 8 h ，菌 液浓度分别为 9.0 10 5 CFUmL和 6.0 105 CFU mL ，备用 。 2.4.2 检测 TCDCANa 体外抗茵作用 采用 KB法( 新华 I 号滤纸，打孔器制备纸片直径为6 mm, 每片药量 500 微克，另取无菌 水滤纸片作阴性对照，
11、以青霉素滤纸片作阳性对照用无菌棉签将上述菌液均匀涂布于 LB 固体 培养基上，在每个平板表面贴验试纸片、阴性对照纸片和阳性对照纸片。然后将贴好纸片的平 板置 3 7温箱中培养 18 24 h，观察结果。用数显游标卡尺测量抑菌环的直径( 包括贴片 ) ， 并记录测量数据。实验重复4 次。 2.4.3 检测 TCDCANa 抗炎作用 采用二甲苯致炎法，选取 (262 )g 的雌性健康小鼠 48 只，随机分成 4 组。按表 2 所示 4 4 剂量灌胃，每天两次，给药6 d ，于最后一次给药后 1h ，用 0.05 mL 的二甲苯将小鼠右耳致 炎， 致炎后 4 h 将小鼠处死，沿耳根剪下双耳，用直径
12、7 mm 的打孔器将双耳重叠打孔，将 打下的圆耳片在分析天平上称量，用同一小鼠的两圆耳片的质量差表示肿胀度。 2.4.4 检测 TCDCANa 镇咳作用 采用浓氨水引咳法，选取( 20 2 )g健康小鼠，雌雄各半随机分组。将小鼠放于密封的 钟罩内，用玻璃雾化器喷人浓氨水，1 min 后，立即取出小鼠，置烧杯内观察，以小鼠腹肌收 缩、 张口为咳嗽指标，记录1min 内咳嗽次数 ( 无咳嗽或咳数少于3 0 次的为不敏感，予以弃 之) ， 立即灌胃给药。空白对照组给生理盐水 0.5 mL 只；阳性对照组给可待凶注射剂0.5 mL 只； 实验组给质量浓度为 10 mg mL 的 TCDCANa 和鹅去
13、氧胆酸钠 (CDCANa) 的水溶液 0.5mL 只。 1h 后，依上法给予氨气刺激，记录给药后的咳嗽次数。 3 结果与讨论 3.1 TCDCANa的合成及结构表征 采用混合酸酐法合成TCDCANa，其特点是步骤少，中间产物少，转化率高, 反应条件易控 制 ( 可形象比喻为“一锅煮” ) ，产物的分离提纯采用萃取、结晶相结合的方法，不需要色谱 分离( 色谱分离法是目前得到高纯度产品的主要分离手段)，即可得到 (TCDCANa)= 92 以 上的产品。重复性好，回收率高，便于工业化生产。 在文献资料 1 中采用改进的 Bondi-Mueller 法合成了牛磺胆酸钠 (TCANa ) ，产物以溶剂
14、萃取法和结晶法分离提纯制得(TCANa)=92 以上的 TCANa ，收率 59，该法步骤多，中间产物多，产物易溶于水，给分离提纯带来困难。 在用混合酸酐法合成 TCDCANa 的过程中，首先由CDCA 、正三丁胺和氯甲酸乙酯反应生成混合 酸酐，该步骤严格控制在无水条件下进行。向混合酸酐中滴加牛磺酸的NaOH 溶液时，要控制 滴加的速度，防止反应过于剧烈而冲料，要求在15 min 内加完，以确保交换反应的协调进行。 产物的分离提纯仍采用萃取和结晶相结合的方法，TLC检查除主斑点之外无其他可见斑点，表 明 ( TCDCA Na ) 不小于 92 ( R f 值为 0.52) 与对照品 TCDCA
15、Na ( Sigma公司产品 ) 一 致，收率 63。 TCDCA 的 IR 谱图如图 1 所示。 5 5 解析 ( cm -1 ) ：3421( OH + NH)， 2932 ( as C H )，2867 ( s C H )，1643( C=0 ),1548( N H ) ， 1446(as C H ),1373 (s C H),1208 ( S=0 ), 1049(s S=0 ) , 。与对照品的 红外光谱一致。由I R结果可知 ,3421 cm -1 的强峰为伯胺 NH键和羧基 O一 H键的伸缩振动吸 收峰，且仲胺基 ( 1548 cm -1 ) ，酰胺基 (1643 cm -1 )
16、，磺酸基 ( 1208 、1049 cm -1 ) 等特征 吸收峰的存在， 显示其结构中有酰氨基 ( 一 CONH 一 ) 和磺酸基 , 为结合型胆汁酸。 3.2 TCDCANa的药效作用 3.2.1 体外抗菌作用 由表 1 可知，对金黄色葡萄球菌的抑菌实验表明，阳性对照和两种实验纸片周围均出现了 较大而清楚的抑菌环， 说明 CDCANa 和 TCDCANa 对革兰氏阳性菌一金黄色葡萄球菌有抗菌作用， 并且在相同浓度下， TCDCANa 的抗菌作用显著强于CDCANa ( P 0.01 ) 。对大肠埃希菌的抑 菌实验表明，阳性对照和各试样周围均未出现抑菌环，说明TCDCANa 和 CDCANa
17、 对革兰氏阴性 菌大肠杆菌无抗菌作用。这可能是TCDCANa 影响细菌 DNA合成和修复，甚至中断细菌 DNA 的合成，因而产生抑菌作用。但革兰氏阴性菌细胞壁含有丰富的脂多醣，通透性差，具有非常 有效的通透屏障作用，阻止了抗菌药物进入菌体内，从而影响了抗菌效果。 6 6 3.2.2 抗炎作用 以二甲苯致炎法对比了TCDCANa 和 CDCANa 的抗炎作用。结果见表2 。 结果表明， TCDCANa 和 CDCANa 对二甲苯致炎具有明显的抗炎作用( P0.01 )，且 TCDCANa 的作用强于 CDCANa (P0.01 )， 显示 TCDCANa 比 CDCANa 有明显的抗炎效果。 3
18、.2.3 镇咳作用 采用浓氨水引咳法， 考察了 TCDCANa 与 CDCANa 对熏氨小鼠的镇咳作用。 为便于比较， 镇咳作用以减咳率表示。按下式计算每只小鼠的减咳率，结果见表3。可见， TCDCANa 和 CDCANa 对熏氨引咳的小鼠均有明显的镇咳作用( P 0.01)，TCDCANa 的作用强于 CDCANa ( P0.01 ) 。 7 7 4 结论 以 CDCANa 为原料以“一锅煮”的方法合成了TCDCANa，并将 TCDCANa 与其游离型 式 CDCANa 进行了药效实验对比，结果表明，以混合酸酐法可制得TCDCANa，其收率超过 63，不经色谱分离即可得 （CDCANa）=9
19、2以上的产品。药效实验表明，TCDCANa 和 CDCANa 均具有明显的抗菌、 抗炎和镇咳作用， 且 TCDCANa 的作用强于 CDCANa ( P0.01)。 鸡胆、蛇胆、熊胆等天然胆汁中主要含结合胆汁酸，游离胆汁酸含量极微或无，结合上述研究 结果提示，这些动物胆汁对抗菌、抗炎和镇咳起主要作用的成分是结合胆汁酸。胆汁酸盐是一 类表面活性剂， 当其分子中结合了水溶性氨基酸后，亲水性明显增强， 其表面活性也相对增强， 它对生物膜的通透性及膜的表面结构将产生更大的影响。牛磺鹅去氧胆酸钠是蛇胆汁和鸡胆汁 中的主要胆汁酸成分之一，TCDCANa 是蛇胆汁的胆汁类药物的一种有效成分，结合型胆汁酸 的
20、作用强于游离型胆汁酸。 5 致谢 本课题在选题及研究过程中得到各位老师的悉心指导。指导老师曾多次询问论文和实验进 程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。老师一丝不苟的作风，严 谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给以终生受益无穷之道。对 老师的感激之情是无法用言语表达的。 感谢各位指导老师对我的教育培养。他们细心指导我的学习与实验，在此，我要向诸位老师深 深地鞠上一躬。 最后，向我的父亲、母亲、弟弟及所有的新朋好友致谢，感谢他们对我的理解与支持。 8 8 参考文献： 1 公瑞煜，李建蓉，张亚，等牛磺胆酸钠的制备及与胆酸的药效的对比 J 精细化工， 2
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