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1、大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 1微生物、细菌与大肠杆菌之间有怎样的关系？ (1)概念内涵：其关系图解见下 (2)结构上 ： 三者都是结构简单，形体微小的生物，但是从细胞角度看其结构是不同的， 具体如下： 2培养大肠杆菌的 LB 培养基中有各种物质，为什么选择这些物质，这些物质有什么作 用呢？ (1)人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出了供其生长繁殖的营养基质培 养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有五大营养要素，即水、无机盐、碳源 (提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生长因子(不同的细菌需要的各不相同，有物种差异， 它主要补充自身不能合成的或合成能力较弱的，但却是生
2、长繁殖必需的物质)。见下表： 微生物的营养要素定义功能类型 化合物 类型 常用物质 无机 碳(自 养型 微生 物用) 无机物 CO2、 NaHCO3、 CaCO3等 碳源 凡可构成微生物细 胞和代谢产物中碳 架来源的营养物质 称为碳源 构成细胞物质，供 给微生物生长发育 所需要的能量 有机 碳(异 养型 蛋白 质、核 酸类 牛肉膏、 蛋 白胨、 花生 粉饼、明 胶、 氨基酸 等 微生 物用) 糖类脂 质等 葡萄糖、 蔗 糖、 淀粉等 铵盐 NH3、 (NH4)2SO4 硝酸盐KNO3 无机 氮 N2空气 氮源 凡是构成微生物的 细胞物质或代谢产 物中氮素来源的营 养物质称为氮源 主要是提供合成
3、原 生质和细胞其他结 构的原料，一般不 作能源有机 氮 牛肉膏、蛋白胨、醇 母膏、尿素、明胶等 生长因子 一类对微生物正常 代谢必不可少且又 不能从简单的碳、 氮源自行合成的所 需极微量的有机物 一般是酶和核酸的 组成成分 酵母膏、 玉米浆、 黄豆饼粉、 动植物组织液、麦芽汁等， 复合维生素 水作用：组成成分；反应介质；物质运输媒体；热的良导体 无机盐作用：维持渗透压、pH 等 (2)大肠杆菌的 LB 培养基 本实验中大肠杆菌 LB 培养基 配方 微生物的营养要素 LB 液体培养 基 LB 固体培养 基 培养基配方与微生物营养要 素的对应关系 琼脂 1 g 蛋白胨 0.5 g 主要提供大肠杆菌
4、的氮源、 碳 源需求 酵母提取物 0.25 g主要提供生长因子 NaCl 0.5 g提供无机盐 氮源、 碳源、 无机盐、 生长因子、 水 水 50 mL提供水 (3)此外配方中还要注意 pH 等。 3该实验中这些操作的原因 (1)三角锥形瓶中的 LB 固体培养基灭菌后，需要冷却到 60 左右时，才用来转移和分 装，制成固体平面培养基，为什么？你用什么简易方法快速估计该温度？ 因为三角锥形瓶中的 LB 固体培养基中有琼脂， 它在 98 以上熔化， 在 44 以下凝固， 当冷却到 60 左右时，不会因温度过高烫手而不易操作；也不会因为温度过低而使三角锥 形瓶中的培养基凝固，最终无法转移分装制成新的
5、平面培养基。 简易估计温度的方法 ： 可以用手触摸灭菌后的三角锥形瓶，感觉锥形瓶由烫手转为刚刚 不烫手时，则说明已经冷却到 60 左右了。 (2)进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置？ 恒温培养时， 培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发， 倒放培养皿则会使水蒸气凝结成 水滴留在盖子上 ； 如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果 培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达 不到分离的目的，培养皿中的菌落还有可能被盖子上掉落的水给污染。 (3)将大肠杆菌用接种环自斜面转移到液体培养基中培养时，为什么接种环必须先深入 到斜面冷却后，才能再
6、取斜面上的菌体？ 接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，一直灼烧至红，温度很高，若不冷却就 直接用其取斜面上的菌体， 菌体可能因为接触高温接种环而死亡， 导致大肠杆菌的转移培养 失败。 (4)用划线法分离大肠杆菌中，第一次和随后的几次划线前都要灼烧接种环，它们的原 因一样吗？在划线结束后仍然要灼烧接种环这又是为什么呢？ 虽然每次灼烧都是为了灭菌，但所灭的菌种和原因却不一样。 灼烧接种环 的时间 消灭的菌体原因 第一次划线 前 其他杂菌防止其他杂菌的侵入而造成污染 随后的几次 划线前 上次划线结束后残留在接种环上的实 验菌(本实验为：大肠杆菌) 为了使下一次划线时，接种环上的菌 来自上次划线
7、的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数 目逐渐减少，最终获得单个菌落，实 现菌的分离 最后一次划 线结束后 为了防止实验菌残留于接种环而污染环境和感染实验人员 (5)用划线法分离大肠杆菌时，每次的划线是怎么样的？对随后的划线的起点有什么要 求？为什么这样要求呢？ 每一次的划线 依次的 2 次划线之间 的关系 各次划线的分布 图形辅助理解 划线的要求不能出现线条的重叠 第二次以及随后的划 线操作，总是从上一 次划线的末端开始 不要将最后一区的划 线与第一区相连 这样要求的原因 使线条末端细菌的数 目比线条起始处要少 因为划线后，线条末 端细菌的数目比线条 起始处要少，每次从 上一
8、次划线的末端开 始，能使细菌的数目 随着划线次数的增加 而逐渐减少，最终得 到有单个细菌繁殖而 来的单菌落 若相连，则可能最后 一次划线末端处的细 菌与第一次的叠加， 细菌的数目不是最少 的，不能使细菌的数 目随着划线次数的增 加而逐渐减少，最终 将很难获得单菌落 4消毒与灭菌一样吗？ 概念常用方法应用的范围 煮沸消毒法 ： 在 100 煮沸 56 min 一般物品 巴氏消毒法：7075 煮 30 min 或在 80 煮 15 min 对于一些不耐高温的液体， 如牛奶 消毒 使用较为温和的物理或 化学方法仅杀死物体表 面或内部一部分对人体 有害的微生物(不包括 芽孢和孢子)化学药剂消毒法 如用
9、酒精擦拭双手、用氯气 消毒水源等 灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌 干热灭菌 ： 160170 下灭 菌 12 h 玻璃器皿、金属工具的灭菌 灭菌 使用强烈的理化因素杀 死物体内外所有的微生 物(包括芽孢和孢子)高压蒸汽灭菌：121 条件 下，灭菌 1530 min 培养基及容器的灭菌 5.本实验中还需要了解哪些基础知识才更便于掌握和理解呢？ (1)牛肉膏蛋白胨的知识 牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。 1 000 mL 牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 培养基组分提供的主要营养 牛肉膏 5 g碳源、磷酸盐和维生素 蛋白胨 10 g氮源和维生素 NaCl 5 g无机
10、盐 H2O 定容至 1 000 mL氢元素、氧元素 (2)巴氏消毒法的知识 巴氏消毒法也称做低温消毒法。 日常生活中经常用到煮沸消毒法。在 100 煮沸 56 min 可以杀死微生物的营养细胞 和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则使用巴氏消毒法，在 7075 煮 30 min 或在 80 煮 15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。 题例领悟 TILILINGWU题例领悟 TILILINGWU 【例题 1】 下列操作属于灭菌的是( ) A用酒精擦拭实验人员的双手 B用氯气处理水源 C将接种环在酒精灯火焰上灼烧至红 D杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微
11、生物 解析：解析：此题考查对微生物实验中灭菌的理解。对微生物培养来说，灭菌操作十分重要， 其目的就是为了获得纯净的培养物， 其关键是防止外来一切杂菌的入侵， 不仅仅是对人体有 害的微生物。灭菌操作一般使用强烈的物化因素(如 ： 灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌等)。而不是 使用较为温和的物化方法。 答案：答案：C 消毒与灭菌是不同的。 两者除了在物化手段上是否强烈外， 所消灭的微生物内容也是不 同的。灭菌是消除一切杂菌，而消毒仅仅杀死对人体有害的微生物。消毒往往无法消灭微生 物的芽孢和孢子。 【例题 2】 下列关于平板划线的操作及叙述，正确的是 ( ) A灼烧接种环之后，为避免其他杂菌的干扰，应立即伸入
12、菌液取菌种 B划线结束后，为避免实验菌污染环境和感染操作者，所以必须再次灼烧接种环 C在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的相同 D划线时最后一区域一定要与第一区域相连，达到首尾相接 解析：解析：此题考查对划线法分离大肠杆菌的掌握。这是本实验的一大重点和难点。A 的操 作是错误的，灼烧接种环之后，要冷却后方能取菌种，以免温度太高杀死菌种。B 的操作完 全正确。C 的叙述是错误的，它们的灼烧目的完全不同，第一次划线前的灼烧是为了杀死其 他杂菌，保证实验菌的纯净，而随后的灼烧却是为了杀死残留于接种环上的实验菌，保证实 验菌随划线次数的增加而减少，每次划线的菌种来自上一次划线的末端。D
13、 的操作也是不正 确的，不应该相连，这样才能使最后一次划线不受第一次划线的干扰。 答案：答案：B 大肠杆菌的分离所采用的就是划线分离法。 这一方法十分重要。 我们不仅要知其每一步 具体的操作，还要知其所以然，还要关注注意事项，避免踏入误区。 随堂训练 SUITANGXUNLIAN随堂训练 SUITANGXUNLIAN 1 细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法 依次用于杀灭哪些部位的杂菌( ) A接种针、手、培养基 B高压锅、手、接种针 C培养基、手、接种针 D接种针、手、高压锅 答案：答案：C 解析：解析：灭菌是微生物培养过程中的重要环节。其中高压蒸汽是为了杀灭培养 基中的杂菌；酒精擦拭双手，是灭手上的杂菌；而接种针在火焰上灼烧，就是为了灭接种针 上的菌。故 C 选项是正确的。 2 下列关于倒平板的操作姿势的叙述中，正确的是( ) A右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶封口膜 B右手大拇指、食指拿着三角瓶 C左手拿着培养皿，盖子放于桌子上 D倒平板时，为防止温度过高，暂时熄灭酒精灯 答案：答案：A 解析：解析：倒平板技术是微生物技术中的基本技术。只有 A 是正确的。B 中手指 姿势错误。C 错在培养皿盖放在桌上了。D 中熄灭酒精灯不对，整个过程都需在酒精灯火焰 旁完成。