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1、课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.研究培养基对微生物的选择作用。 2.进行微生物数量的测定。 一二三 一、研究思路 1.筛选菌株 尿素是一种重要的农业氮肥,但不能直接被农作物吸收,只有当 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后,才能被植物利用。土壤中的细 菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶。 (1)实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌株生长的 条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物生长。 (2)选择培养基:在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同 时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,称做选择培养基。 一二三 2.统计菌落数目 (1)常用来统计样
2、品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。即当 样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品 稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品 中大约含有多少活菌。为了保证结果准确,一般选择菌落数在 30300的平板进行计数。 该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两 个或多个细胞在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。因此,统 计结果一般用菌落数来表示。 (2)显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 一二三 3.设置对照 (1)对照实验是指除了被测试的条件以外,其他条件都相同的实验, 其作用是比照实验组,排除任何其他可能原因的干扰,证明确实是 所测试的条件
3、引起相应的结果。 (2)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果 的影响,提高实验结果的可信度。 一二三 二、实验设计 实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体 的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。某土壤样品中细 菌的分离与计数实验的操作步骤如下。 1.土壤取样 土壤中的微生物70%90%是细菌,绝大多数分布在距地表38 cm 的近中性的潮湿土壤中。 2.样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。通常选用 一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数在30300之间、 适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量,一般选用104、105和106 倍的
4、稀释液进行平板培养。第一次实验时,可将稀释范围放宽一点, 以保证能从中选择出适于计数的平板。 一二三 3.微生物的培养与观察 (1)不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。细 菌一般在3037 的温度下培养 12 d;放线菌一般在2528 的温 度下培养57 d;而霉菌一般在2528 的温度下培养 34 d。 (2)实验中,每隔24 h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记 录作为结果,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 (3)一般来说,在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养 时间),同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括菌落 的形状、大小、隆起程度和颜色等
5、方面。 土壤有“微生物的天然培养基”之称,为什么? 提示:土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸 碱度、渗透压和温度等条件,是微生物生活的良好环境。 一二三 三、对分离得到的分解尿素的细菌的鉴定 1.检测pH的变化 在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨。氨会使培养基的碱性增强,pH升高。因此,可以通过检测培养 基pH的变化来判断该化学反应是否发生。 2.利用指示剂 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌 后,如果pH升高,指示剂将变红,说明该种细菌能够分解尿素。 一二三四 一、选择培养基 1.选择培养基的制作 (1)依据某些微生物对某种物质
6、的抗性,在培养基中加入此种物质, 以抑制对该物质不具抗性的微生物生长,而不影响对该物质具有抗 性的微生物生长。如在培养基中加入青霉素,可抑制细菌、放线菌 的生长,从而分离得到酵母菌和霉菌。 (2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的。培养基 中缺乏氮源时,可分离固氮微生物,非固氮微生物因缺乏氮源而无 法生存;培养基中若缺乏有机碳源,则异养微生物无法生存,而自养 微生物可利用空气中的CO2制造有机物。 一二三四 (3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物。如当石油是唯 一碳源时,可抑制不能利用石油的微生物生长,而能利用石油的微 生物能够生存,从而分离出能消除石油污染的微生物。 (4)通
7、过某些特殊环境分离微生物。如在高盐环境中可分离得到 耐盐微生物,其他微生物在盐浓度高时因易失水而不能生存;在高 温环境中可分离得到耐高温的微生物,其他微生物在高温环境中因 酶失活而无法生存。 2.利用选择培养基分离能分解尿素的微生物的原理 分离能分解尿素的微生物所用的选择培养基的氮源只有尿素。 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,缺乏脲酶的微生物不能分 解尿素,因缺乏氮源而不能生长、繁殖,所以用此培养基就能够分 离出能分解尿素的微生物。 一二三四 二、显微镜直接计数法与稀释涂布平板法的比较 显微镜直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一 种常用的微生物计数方法。此法是将经过适当稀释的
8、菌悬液置于 血球计数板的载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下进行计 数。由于计数室的容积是一定的,所以可以根据在显微镜下观察到 的微生物数目来换算单位体积内的微生物总数目。由于此法计得 的是活菌和死菌数目的总和,故又称为总菌计数法。此法的优点是 直观、快速,但需要与血球计数板配套使用,且计数随机性大,所以 不能较为宏观、全面地反映菌体数量。 稀释涂布平板法通常要做梯度稀释,所以计数的线性范围大。由 于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好地反映菌落的疏密程度,具 有重复性、平行性,是经典的计数方法。但需要平板上长出菌落后 才能计数,因此速度慢是该方法最大的缺点。 一二三四 三、在土壤中采集菌样
9、的方法与要点 由于土壤中的微生物数量大、种类多,所以土壤往往是首选的菌 样采集目标。土壤采样必须考虑以下几个方面。 1.土壤中有机物的含量 通常,有机物含量高、土质较肥的土壤中微生物较多,反之,微生 物较少。 2.采样的深度 土壤的深度不同,其通气、养分和水分的分布情况也不同。表层 的土壤直接受日光暴晒,故较干燥,微生物不易大量繁殖。在离地 面38 cm处的土壤中,微生物含量最高。 3.植被情况 植被的种类与微生物的分布有着密切的关系。例如,在冬天灌水 的水稻田土壤中,真菌分布得较多。 一二三四 4.采样的季节 以春、秋两季为宜。这时土壤中的养分、水分和温度都较适宜, 微生物的数量也较多。采样
10、时尤其应注意土壤的含水量,水分过多 会造成厌氧环境,不利于放线菌的生长繁殖。真菌虽需要较高的相 对湿度,但水分不宜过多,因此,要避免在雨季采集土样。此外,还要 考虑土壤的pH,细菌和放线菌在中性或微碱性土壤中居多,而真菌 则在偏酸性的土壤中较丰富。 5.采样方法 选择好适当的采样地点后,用小铲子除去表土,取38 cm 深处的 土样几十克,盛入事先灭过菌的防水纸袋内,并在上面记录采样时 间、地点和植被等情况。 一二三四 四、实验设计注意事项 1.设置重复组 实验要有足够的次数,才能避免结果的偶然性,使结论更有说服 力与准确性。在该实验中,可在每个稀释度下设置3个选择培养基 平板;计数时在同一稀释
11、度下,至少对3个平板进行重复计数,求平均 值。这样也可以为实验是否成功提供参考。若重复组结果差别较 大,则意味着操作有误,需要重新实验。 一二三四 2.设置对照 对照的设置也会增加实验结果的可信度和说服力。在该实验中, 可在配制培养基时,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基两种培 养基,牛肉膏蛋白胨培养基作为对照,用来判断选择培养基是否起 到了选择作用,在相同的稀释度下,牛肉膏蛋白胨培养基上生长的 菌落数应明显多于选择培养基上生长的菌落数。另外,要设置空白 对照,即在培养基中不加土样,如果空白对照的培养基上没有菌落 生长,则说明培养基没有被杂菌污染。 题型一题型二题型三 题型一 选择培养基的特点
12、与应用 【例题1】 甲、乙、丙是三种微生物,下表、是用来培 养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在中正常生长繁殖;甲 能在中正常生长繁殖,而乙和丙都不能;乙能在中正常生长繁 殖,甲、丙都不能。下列说法正确的是( ) 注:“+”表示培养基中加入了这种物质,“-”表示培养基中没有加入 这种物质。 题型一题型二题型三 A.甲、乙、丙都是异养型微生物 B.甲、乙都是自养型微生物,丙是异养型微生物 C.甲是异养型微生物,乙是固氮微生物,丙是自养型微生物 D.甲是固氮微生物,乙是自养型微生物,丙是异养型微生物 解析:培养基缺少N元素, 培养基缺少有机物,培养基营养 全面。N是微生物生长的必需元素,每一种微
13、生物正常生长都需要 N,只有自己能够固氮的微生物才可以生活在无氮培养基上。甲能 在中生长繁殖,而乙、丙都不能,说明甲是能够固氮的微生物。 乙能在中生长繁殖,甲、丙不能,说明乙不需要培养基为它的正 常生命活动提供能源物质,乙一定为自养型微生物,甲、丙都为异 养型微生物。 答案:D 题型一题型二题型三 题型二 测定细菌数量的原理与方法 【例题2】 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在 对应稀释倍数为106的培养基中, 得到以下几种统计结果,正确的是( ) A.涂布了1个平板,统计的菌落数是230 B.涂布了2个平板,统计的菌落数是215和260,取平均值238 C.涂布了3个平板,统计的
14、菌落数分别是21,212和256,取平均值 163 D.涂布了3个平板,统计的菌落数分别是210,240和250,取平均值 233 题型一题型二题型三 解析:在设计实验时,每个稀释度一定要至少涂布3个平板作为重 复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B两项错误。C项 虽涂布了3个平板, 但是,其中 1个平板的计数结果与另2个相差太 远,说明在操作过程中可能出现了错误,因此,不能简单地用3个平板 的计数值求平均值。 答案:D 反思领悟在设计实验时,每个稀释度一定要至少涂布3个平板作 为重复组;在分析实验结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果 是否一致,如果结果差别过大,则意味着操作可能有误,需重新实验。 题型一题型二题型三 题型三 筛选微生物的方案设计 【例题3】 为了判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置 的对照是( ) A.未接种菌液的选择培养基 B.未接种菌液的牛肉膏蛋白胨培养基 C.接种了菌液的牛肉膏蛋白胨培养基 D.接种了菌液的选择培养基 解析:接种了相同稀释倍数的菌液,牛肉膏蛋白胨培养基上生长 的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目,因此,应以接种 了菌液的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。 答案:C