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1、 1.限制酶的选择原则限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出切出”，如图甲可选，如图甲可选 择择Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择 Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的 基因和质粒，如图甲
2、也可选择用基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和和EcoR 两种限制酶两种限制酶(但要确保质粒上也有这但要确保质粒上也有这 两种酶的切点两种酶的切点)，而且这种切点不致于破坏所有的，而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因标记基因”以及启动子和终止子以及启动子和终止子 。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类根据质粒的特点确定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽
3、量不要破坏这些结构 ，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不因其会破坏标记基因而不 宜选择。宜选择。 所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止 一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重 组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙
4、中所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子会破坏启动子 ，EcoR会破坏终止子，而会破坏终止子，而Nde和和BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与切出的切口可让目的基因嵌入启动子与 终止子之间。终止子之间。 (3)参考参考Ti质粒的质粒的TDNA片段选择限制酶片段选择限制酶 若质粒上标出若质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于片段中，从而有利于 将目的基因嵌入到将目的基因嵌入到TDNA片段上片段上因为因为Ti质粒的质粒的TDNA片段最易转移至受体细片段最易转移至受体细 胞并且整合到受体细胞染色体胞
5、并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶上，如用两种限制酶Xba 和和Sac (两种酶切出两种酶切出 的黏性末端不同的黏性末端不同)切割某切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达 载体，则下图中甲、乙、丁，载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。质粒宜选取。(分析如下分析如下) 2.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 (1)界定界定“标记基因标记基因”与与“DNA分子杂交技术分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：在目的基因检测中的作用： 载体上标记基因的标记原理载体上
6、标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没 有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性 基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培 养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基 中不能存活，
7、则表明无质粒转入，当然不会有中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因目的基因”转入，能存活时必含转入，能存活时必含 该载体，原理如下图所示：该载体，原理如下图所示： “标记基因标记基因”筛选后为何还需应用筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术分子杂交技术”确认目的基因是否转入确认目的基因是否转入 ？ 经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上 是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因目的基因”作探针，利用作探针，利用 DN
8、A分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。 (2)使用使用“目的基因目的基因”作探针，运用作探针，运用“分子杂交技术分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定检测目的基因是否转录出特定 mRNA。 (3)采用采用“抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原作抗原)与相应抗体与相应抗体 杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导指导”特定蛋白质的合成。特定蛋白质的合成。 (4)采用抗虫、抗病毒等采用抗虫、抗病毒等“接种实验接种实验”进行目的基因
9、成功表达的进行目的基因成功表达的“个体生物学个体生物学”水平水平 的检测。的检测。 【例证】【例证】 (2016全国卷全国卷，40)图图(a)中的三个中的三个DNA片段上依次表示出了片段上依次表示出了EcoR、 BamH和和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达为某种表达 载体的示意图载体的示意图(载体上的载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的的切点是唯一的)。 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1)经经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后得到的目的基因可以与
10、上述表达载体被 酶切后的产物酶切后的产物 连接，理由是连接，理由是_ _。 (2)若某人利用图若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA 分子，如图分子，如图(c)所示，这三种重组所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物 的有的有 ，不能表达的原因是，不能表达的原因是_ _。 图图(c) (3)DNA连接酶是将两个连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有片段连接起来的酶，常见的有 和和 ，其，其 中既能连接黏性末端又能连接平末端的是中既能连接
11、黏性末端又能连接平末端的是_。 慧眼识图 获取信息慧眼识图 获取信息 (1)三种限制酶切割结果分析三种限制酶切割结果分析 (2)表达载体与重组表达载体与重组DNA分子分析分子分析 答案 答案 (1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲甲、丙 甲 中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的 基因均不能被转录 基因均不能被转录 (3)EcoliDNA连接酶 连接酶 T4DNA连接酶 连接酶 T4DNA连接酶连接酶 1.(2
12、019湖南长沙长郡中学月考湖南长沙长郡中学月考)下图是利用工程菌下图是利用工程菌(大肠杆菌大肠杆菌)生产人生长激素的实验流生产人生长激素的实验流 程。所用的程。所用的pBR322质粒含有限制酶质粒含有限制酶Pst 、EcoR 和和Hind 的切点各一个，且三的切点各一个，且三 种酶切割形成的末端各不相同，而种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素表示四环素 抗性基因。请回答以下相关问题：抗性基因。请回答以下相关问题： (1)过程过程所用到的组织细胞是所用到的组织细胞是 ，过程，过程所用的酶是所用的酶是 。过程常过程常 用用 溶液处
13、理大肠杆菌。溶液处理大肠杆菌。 (2)经经过程得到的互补过程得到的互补DNA片段，称为片段，称为 。 (3)如果用限制酶如果用限制酶Pst 、EcoR 和和Hind 对图中质粒进行切割，用一种酶、两对图中质粒进行切割，用一种酶、两 种酶和三种酶分别切割时形成的种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形 成的成的DNA片段种类片段种类 (填填“相同相同”或或“不同不同”)，这些种类的，这些种类的DNA片段中含片段中含 有完整氨苄青霉素抗性基因的有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的片段和四环素抗性基因的DNA片段
14、分别有片段分别有 种和种和 种。种。 (4)如果只用限制酶如果只用限制酶Pst 切割目的基因和质粒，完成过程切割目的基因和质粒，完成过程、后后(受体大肠杆菌受体大肠杆菌 不含不含Ampr、Tetr)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用 无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置 上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是 筛选筛选
15、 的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活 的大肠杆菌体内导入的是的大肠杆菌体内导入的是 。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和 丙上的生存情况是丙上的生存情况是_。 (5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本 操作中的操作中的_ 步骤。该基因工程中的步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是质粒彻底水解的产物是_ 。 解析解析 (1)过程过程获得的是人生长激素获得的是人生长激素mRNA，所以
16、组织细胞取自人垂体组织细胞；，所以组织细胞取自人垂体组织细胞； 过程过程构建基因表达载体的酶是构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程连接酶；过程将基因表达载体导入大肠杆菌将基因表达载体导入大肠杆菌 前，常用前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。(2)过程是人的生长素过程是人的生长素 mRNA逆转录形成逆转录形成cDNA的过程。的过程。(3)Pst 、EcoR 和和Hind 三种酶的切点分别用三种酶的切点分别用 1、2、3表示，一种酶酶切时，一共可以得到表示，一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，种相同长度的片段；两
17、种酶酶切时， 可得到可得到12，21，23，32，13，31六种片段；三种酶酶切时，可得到六种片段；三种酶酶切时，可得到1 2，23，31三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时三种片段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时 形成的形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这片段种类相同。这 些种类的些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的片段和四环素抗性基因的 DNA片段分别有片段分别有3种和种和3种。种。 (4)在
18、甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中 能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的能生长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒质粒 或含有或含有Ampr、Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中 这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了 氨苄青霉素抗性基因，使含
19、有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养 基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环基上生长，但四环素抗性基因是完好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环 素的丙培养基上生长。素的丙培养基上生长。(5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程 ，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒质粒 的化学本质是的化学本质是DNA，其彻底
20、水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。 答案答案 (1)人垂体组织细胞 人垂体组织细胞 DNA连接酶 连接酶 CaCl2 (2)cDNA (3)相同 相同 3 3 (4)含四环素抗性基因 完整的含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒质粒(或含有或含有Ampr、Tetr的质粒的质粒) 在丙中能存 在丙中能存 活，在乙中不能存活 活，在乙中不能存活 (5)筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基 2.(2019河南名校联盟调研河南名校联盟调研)如图所示为培育转基因细菌的操作流
21、程，回答下列问题如图所示为培育转基因细菌的操作流程，回答下列问题 ： (1)图中图中过程所用工具酶有过程所用工具酶有 。为了防止载体和外源。为了防止载体和外源DNA自连，自连， 应如何操作？应如何操作？_ _。 (2)当细菌的转化过程中吸收的外源当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒是病毒DNA时，该转化过程又称转染。图时，该转化过程又称转染。图 中外源中外源DNA来自来自 。为了提高转染效率，应使用。为了提高转染效率，应使用 处理细菌。处理细菌。 (3)图中图中过程，重组过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？增殖时需要哪些条件？_。 (4)图中图中过程，筛选含重组质粒的细菌需用到过程，筛选含
22、重组质粒的细菌需用到 基因的功能。已知所用载体基因的功能。已知所用载体 内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养 基上生长，但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源基上生长，但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源DNA细菌的前提条细菌的前提条 件：件：_ _(答出两点即可答出两点即可) 。 解析解析 根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源 根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自应来自(DNA)病毒。病毒。 另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。 答案答案 (1)限制酶和限制酶和DNA连接酶 应使用两种限制酶同时切割载体和外源连接酶 应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA (2)(DNA)病毒 病毒 Ca2 (3)模板、原料、酶和能量等模板、原料、酶和能量等 (4)标记 原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源标记 原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素插入到载体的青霉素 抗性基因内部抗性基因内部