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1、第 - 9 - 页 共 9 页第一节微生物的分离和纯培养一、培养基1含义由于微生物代谢方式的不同，因而对营养物质的需求也是有差异的。根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将各种营养物质混合在一起而配制的营养基质。2平板培养基将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。二、无菌技术1目的和要求在微生物的分离和纯培养中，一定不能有外来的污染性杂菌，所以必须采用无菌技术进行操作。因此，在实验过程中，要对所用的器材、培养基进行严格的灭菌，对工作场所要进行消毒。2灭菌和消毒(1)灭菌：用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物，常用的方法是高温灭菌法。(2)消毒：用相对温和的理化方法
2、杀死环境或物体上的病原微生物和有害微生物的营养细胞，常用的方法是射线消毒法和化学药剂消毒法。三、接种技术1含义把相应的研究对象移入培养基中的过程。2分类在平板培养基上接种的方法有平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法等。一、微生物的概念及特点1概念微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。2特点二、微生物的营养及功能微生物的化学组成成分与其他生物大体相同，也是由C、H、O、N、P、S等元素组成的，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。这些化合物可归纳成碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类营养要素。营养物质定义作用主要来
3、源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：CO2、NaHCO3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无
4、机化合物(1)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。(2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源，新陈代谢同化作用类型的划分也是以是否能合成含碳有机物为依据，能合成含碳有机物的是自养型生物，反之则为异养型生物。(3)对异养型微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源又是氮源、能源。(4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。一些天然物质如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。三、大肠杆菌的分离方法和实验过程1实验原理微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上
5、，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。2材料用具培养1624 h的大肠杆菌(E.coli)培养液，灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(斜面和平板)，盛有9 mL无菌水的试管，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环等。3方法步骤微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。微生物分离操作流程图(1)稀释：用1 mL无菌吸管吸取 1 mL大肠杆菌培养液，加入盛有9 mL无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次制成101、102、103、104、105
6、、106系列稀释度的大肠杆菌稀释液。(2)划线或涂布平板划线分离法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，沾取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有交叉划线和连续划线两种(如下图)。交叉划线时，每转一个角度灼烧一次接种环。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。划线法示意图涂布分离法：取3个平板，底面分别用记号笔写上104、105和106三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510 min，使菌悬液吸附进培养基(如下图)。涂布法示意图(3)培养：将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中3
7、7 培养1624 h，即可长出单个的菌落。四、平板划线操作应注意的问题第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者(1)灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。(2)划线时最后一区域不要与第一区域相连。(3)画线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。培养基的营养成分下表是某微生物实验室的培养基配方。据表回答问题：编号成
8、分含量(NH4)2SO40.4 gKH2PO44.0 gFeSO40.5 gCaCl20.5 gH2O100 mL(1)上表中培养基可培养的微生物类型是_。(2)此培养液能否用于植物的无土栽培？_，理由是_，若用于无土栽培，还应注意培养液中_的含量。(3)若除去，加入(CH2O)，该培养基可用于培养_。解析培养基中未提供碳源，据此可判定该生物应为自养型，但对植物来说，无土栽培时所用培养液必须是全素(含所有必需元素)培养液，因此，该培养液不可直接用于植物的无土栽培。从培养基中除去(NH4)2SO4(氮源)，加入(CH2O)(有机碳源)，该培养基可用于培养固氮微生物。答案(1)自养型微生物(2)不
9、能缺乏Mg等矿质元素氧气(3)固氮微生物自养型微生物和异养型微生物的营养比较项目自养型微生物异养型微生物碳源CO2、NaHCO3糖类、脂肪酸等氮源NH3、铵盐、硝酸盐等铵盐、硝酸盐、蛋白质等生长因子一般不需要有些种类需要举例硝化细菌乳酸菌下列关于培养基配制的说法，不正确的是()A配制的培养基需要进行灭菌B微生物的适应性强，配制培养基时可以不考虑pHC虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐D配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例BpH影响微生物的生长、代谢和繁殖，因此配制培养基时pH一定要适宜。微生物的纯化氯苯化合物是重要的有机化工原料，不易降解，会污染环境。某研究小组
10、依照下列实验方案(如图a)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表b。图a表b培养基的组成培养基蛋白胨牛肉膏氯苯氯化钠硝酸铵无机盐(无碳)蒸馏水号10 g5 g5 mg5 g1 L号50 mg5 g3 g适量1 L号2080 mg5 g3 g适量1 L下列有关说法正确的是()A图中有筛选作用的只有号培养基B号、号培养基中无碳源只能培养自养微生物C、号培养基中氯苯含量逐渐增加，是为了逐步选择降解氯苯能力强的微生物D微生物中原来就存在能降解氯苯的SP1菌，因此可以直接用号培养基进行一次性选择审题导析解析、号培养基都对SP1菌有筛选作用；从培养基配方可以看出，、号培养基的碳源为氯苯；号培
11、养基中氯苯的含量太高，直接使用，可能无法得到SP1菌(自然状态下具高效降解能力的变异很少)。答案C上题将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养基中培养，得到生长曲线(如下图)，下列叙述不正确的是()A随着氯苯含量升高，SP1菌体数增多B在20 mg/L氯苯的培养基中菌体数最先达到最高C氯苯为SP1菌提供碳源DSP1菌在只含氯苯的培养基中就可以生长D培养基中除了含有氯苯外，还应含有氮源、无机盐等营养物质。1据食品产业网报道，近些年出现的一种膨化食品，合格率仅为76.2%，这两年不断有名牌企业出现食品质量问题，其主要原因大部分为铝含量超标，以及微生物超标。下列关于微生物的叙述中，正确的是()A所有的
12、微生物都是形体微小、结构简单、对人类有害的B微生物包含了除动物界、植物界的其他生物C微生物的结构简单到没有细胞核D微生物的结构简单到没有细胞结构答案B2下列有关平板划线法操作的叙述，不正确的是()A第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种C在每一区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者C在用平板划线法分离大肠杆菌的实验中，接种环取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划
13、线后残留的菌种；划线结束后仍需灼烧接种环，是为了避免细菌污染环境和感染操作者。从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。3(2019全国卷)回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_。硝化细菌在没有碳源的培养基上_(填“能够”或“不能”)生长，原因是_。(2)用平板培养细菌时一般需要将平板_(填“倒置”或“正置”)。(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_。(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过_处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。答案(1)蛋白胨不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同能够硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征(4)灭菌第 - 9 - 页 共 9 页