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1、第2课时 获取目的基因、构建基因表达载体 第一章 第一节 基因工程概述 学习导航 1.概述获取目的基因的方法，特别说明PCR的原理。 2.结合图110，说出基因表达载体的构建。 重难点击 获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。 课堂导入 方式一方式一 抑制疾病传播的转基因蚊子 巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生 虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。 为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。 科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄 蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡
2、， 从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。怎样才能最终 得到转基因雄蚊呢？让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！ 方式二方式二 师：出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解： 问：转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？ 学生看图并回答：首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到Ti质粒 上，然后将重组的Ti质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。 根据学生回答补充：还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此 引出基因工程的四部曲。 一、获取目的基因 内容索引 当堂检测 二、构建基因表达载体 一、获取目的基因 基因组文库：包含某种生物 的基因文库 部分基因文库：包含某种生物 的基因文
3、库 基础梳理 1.通过基因文库获取目的基因通过基因文库获取目的基因 (1)概念 先用 等方法将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片 段，再将这些片段分别和 连接起来，导入受体菌的群体并 起 来，各个受体菌分别含有这种生物的 ，这个群体称为基因文库。 (2)种类 载体 酶切 储存 不同基因 全部基因 部分基因 2.通过通过PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 (1)原理： 。 (2)基本过程 加入反应物质：在离心管中加入所需要的模板DNA、 、4种_ 以及 酶。 变性：加热至 左右，使DNA中的 键断裂，双链解开。 退火(复性)：冷却到55 左右， 与单链DNA相应互补序列结合。
4、延伸：加热至72 左右，在 酶的作用下，沿模板延伸子 链，最终合成2条DNA分子。 DNA分子半保留复制 引物脱氧 核苷酸TaqDNA聚合 94 引物 TaqDNA聚合 氢 (3)若PCR过程中，扩增循环的次数是n，则目的基因的量将被扩增 倍。 (4)PCR技术中因为需要在高温下进行，因此TaqDNA聚合酶需要有什么 特性？ 3.通过化学方法直接人工合成目的基因通过化学方法直接人工合成目的基因 如果目的基因较小， 又已知，可以通过DNA合成仪用化 学方法直接人工合成。 2n 答案 答案 具有热稳定性。 脱氧核苷酸序列 问题探究 1.从基因文库中获取目的基因 (1)cDNA文库是从某种生物的某一
5、细胞中提取出mRNA，经逆转录过程 获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？ 答案 答案 答案 由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因 转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅含该 生物的部分基因。 (2)结合概念，从范围上比较基因组文库和cDNA文库(部分基因文库)之间 的大小关系： 。 (3)基因文库的组建过程所包含基因工程的步骤 目的基因的获取：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的 ，将DNA切成一定范围大小的 。 重组质粒的构建：将所获得的DNA片段分别与 连接起来。 目的基因导入受体细胞：将 导入受体菌的群体中储存。 基
6、因组文库cDNA文库 限制酶DNA片段 载体 重组质粒 比较项目DNA复制PCR技术 区 别 解旋方式_ 场所_ 酶_ 温度细胞内温和条件控制温度，需在较高温度下进行 结果合成DNA分子合成DNA片段或基因 2.PCR技术与DNA复制的比较 解旋酶催化DNA在高温下变性解旋 细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪中) 解旋酶、DNA聚合酶热稳定的DNA聚合酶 联 系 (1)模板：均需要 作为模板 (2)原料：均为_ (3)酶：均需_ (4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链 的合成 脱氧核苷酸双链 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 两种人工合成目的基因的方法比较 (1
7、)逆转录法 主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的 mRNA为模板，借助逆转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚 合酶的作用下合成双链DNA。其过程如下图： 归纳归纳 总结总结 (2)化学合成法 即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直 接合成目的基因。其过程如下图： 由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和 表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基 因的方法。 拓展应用 1.为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育 低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。
8、据图回答下列 问题： 解析 解析 B过程是以RNA为模板合成DNA的逆转录过程，需要的酶是逆转录酶； 目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和 cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。 (1)B过程需要的酶是_。 (2)图中基因组文库_ (填 “小于”“大于”或“等于”) cDNA文库。 (3)目的基因和除可从构建 的文库中分离外，还可以分别 利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶 的显著特点是_。 答案解析 逆转录酶 大于 DNAcDNA 耐高温 解析 解析 PCR技术扩增的原理是DNA半保留复制，需要耐高温的DNA聚合 酶催
9、化，并以脱氧核苷酸为原料。 一题多变一题多变 判断正误： (1)直接分离目的基因的方法其优点是操作简便，缺点是工作量大，具有 一定的盲目性( ) (2)由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成 的方法( ) (3)目前人工合成目的基因的方法主要有两种，分别是逆转录法和化学合 成法( ) (4)PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成( ) 答案 解析 易错辨析易错辨析 认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同 (1)酶：前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。 (2)原料：前者不需要原料；后者需要脱氧核苷酸。 (3
10、)结构：前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子， 只将编码序列导入受体细胞，故无法进行转录。 2.以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图 分析，下列说法正确的是 A.催化过程的酶是RNA聚合酶 B.过程发生的变化是引物与单链DNA结合 C.催化过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温 D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中， A与U之和也占该DNA碱基含量的40% 答案解析 解析 解析 由题意可知，分别表示逆转录、DNA的复制、DNA 解链、引物结合到互补DNA单链及互补链的合成，B正确； 过程由逆转录酶催化完成，A错；
11、 催化过程的酶都是DNA聚合酶，过程是在72 的高温条件下进 行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错； 在DNA分子中有T无U，D错。 3.如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中 正确的是 A.三种方法都需要酶并均在体外进行 B.碱基对的排列顺序均相同 C.三种方法均属于人工合成法 D.方法a不遵循中心法则 解析答案 解析 解析 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶 和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确； 通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的 碱基序列可能有多种，因此碱基对的排列顺序不都相同，
12、B错误； 图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基 因的方法，C错误； 方法a遵循中心法则，D错误。 二、构建基因表达载体 基因表达基因表达载体的构建载体的构建(如图如图) (1)启动子：位于 的一段核苷酸序 列，是 识别、结合的部位，能驱动 基因 。 (2)终止子：是一段特殊的DNA片段，是载体上 的核苷酸序列。 (3)标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否含有 。常用的标记基因 主要是 、某些 。 (4)目的基因：目的基因插在 和 之间。 基础梳理 RNA聚合酶 目的基因上游 转录合成相应的mRNA 终止目的基因转录 目的基因 抗性基因 启动子 生化表型基因 终止子
13、问题探究 结合基因表达载体模式图分析以下问题： 1.用字母和文字表示基因表达载体的组成。 2.启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？ 答案 答案 基因表达载体的组成：a启动子b终止 子c标记基因d复制原点e目的基因。 答案 答案 不是一回事，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需 的部分。而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和 结束。 答案 3.为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？ 答案 答案 启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位 于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。 答案 4.下表中列出了几种限制酶识别
14、序列及其切割位点，图1、图2中箭头表 示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题： 限制酶BamHHindEcoRSma 识别序 列及切 割位点 (1)结合下图重组质粒的构建过程分析： 图中为 ，为 。 答案 同一种限制酶DNA连接酶 答案 答案 不能。因为Sma会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标 记基因。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含 目的基因的细胞筛选出来，若被破坏，无法进一步筛选。 (2)构建基因表达载体时，能否用Sma酶切割质粒？为什么？ 答案 答案 答案 可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。 (3)与只使用EcoR相比较，使用BamH和H
15、ind两种限制酶同时处理 质粒、外源DNA的优点是什么？ (1)选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：选用同一种限制酶切割 会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和 载体连接起来。 (2)基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的 原因：如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两 个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的 基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因 的连接。如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体 以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。 总结总结
16、 提升提升 解析 解析 由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受 体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千 篇一律。 拓展应用 4.下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错 误的是 A.基因表达载体的构建是在生物体外完成的 B.任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C.图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别 和结合的部位 D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导 入了目的基因 解析答案 5.如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程 示意图，其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种
17、限制性核酸内切酶。 下列说法错误的是 A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶Sma C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗 原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 答案解析 解析 解析 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步 骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶 Pst、EcoR。限制酶Sma不可用，它会破坏目的基因的完整性。 抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的 细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 从自然界已有物种中分离:从基因文库中获
18、取 通过PCR技术扩增目的基因 通过化学方法直接人工合成目的基因 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传 至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用 _ _ _ _ _ _ 课堂小结 目的标记 操 作 程 序 获取目 的基因 目的基因：主要指编码蛋白质的结构基因 方法 构建基因 表达载体 组成：_基因+启动子+终止子+_基因 导入目的基因 检测和鉴定目的基因 当堂检测 1.基因工程的基本操作程序有：使目的基因与载体相结合；将目的基 因导入受体细胞；检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；获 取目的基因。正确的操作顺序是 A. B. C. D. 23451 解析 解析 基因工程的主要操作步骤
19、顺序是：获取目的基因构建基因表达 载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。 答案解析 2.如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X 最可能是 A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子 C.限制酶 D.DNA连接酶 答案 23415 解析 解析 启动子是该表达载体所必需的，它应位于插入基因的前端，功能 是启动插入基因的转录过程。 解析 23415 3.以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，下列 说法中错误的是 A.甲方法可建立该细菌的基因组文库 B.乙方法可建立该细菌的cDNA文库 C.甲方法要以脱氧核苷酸为原料 D.乙方法需要逆转录酶参与 答案解析 解析
20、解析 甲方法是从细菌的DNA中直接提取，故可以建立该细菌的基 因组文库；乙方法是由mRNA逆转录获取目的基因，故可以建立该细 菌的cDNA文库。乙方法需要逆转录酶并以脱氧核苷酸为原料。 4.下列有关PCR技术的说法，不正确的是 A.PCR技术的原理是DNA双链复制 B.PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA C.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 D.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸 序列 2341 答案 5 解析 解析 PCR扩增中不使用解旋酶，是利用高温破坏氢键解开双链DNA的， B错误。 解析 5.下图为含铁量较高的转基因水稻的培育过程示意图，请分析回答下列 问题： 23415 (1)获得铁结合蛋白基因有两条途径：一是以铁结合蛋白基因的mRNA 为模板，在逆转录酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 _作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目 标蛋白质的_序列， 推测出相应的mRNA序 列，再推测其DNA的 序列，利用_ (仪器)合成目的基因。 DNA聚合酶 氨基酸 答案 23415 DNA合成仪 (2)重组Ti质粒的结构除了含有标记基因、目的基因、终止子和复制原点外， 还必须有_，它是_结合的部位。 启动子RNA聚合酶 答案 23415