2019_2020学年高二人教版生物选修一课件：5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 .pdf

《2019_2020学年高二人教版生物选修一课件：5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2019_2020学年高二人教版生物选修一课件：5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 .pdf（44页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第14课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段 专题5 DNA和蛋白质技术 学习导航 1.阅读教材P58“(一)”，分析PCR技术与DNA复制的区别和联系，掌握 PCR技术原理。 2.阅读教材P59“(二)”，分析PCR的过程，掌握PCR循环的原理。 3.阅读教材P62“实验操作及操作提示”，掌握PCR技术的实验操作过程 及注意事项。 4.阅读教材P6263“结果分析与评价”，掌握DNA含量测定的方法。 重难点击 1.了解PCR技术的基本操作。 2.理解PCR的原理。 3.讨论PCR的应用。 一、PCR原理与反应过程 当堂检测 二、PCR的实验操作 内容索引 一、PCR原理与反应过程 基础梳理 1.

2、PCR原理与条件原理与条件 (1)PCR的概念 PCR即 ，是一种体外迅速扩增 的技术。它能以 极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 多聚酶链式反应DNA片段 (2)细胞内DNA复制的基本条件 参与的组分在DNA复制中的作用 _打开DNA双链 DNA母链提供DNA复制的_ 4种_合成子链的原料 _催化合成DNA子链 引物使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 模板 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 3 (3)PCR原理 DNA变性：在 的温度范围内，DNA的 将解体， 双链分开，这个过程称为变性。 DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的 又会重新结合 成

3、双链，这个过程称为复性。 子链的合成：DNA聚合酶从引物的 开始延伸DNA链，DNA的合 成方向总是从子链的 向 延伸。 80100 双螺旋结构 DNA链 3端 5端3端 (4)PCR条件 原料： 。 模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。 酶：耐热的 。 引物：使DNA聚合酶能够从引物的 开始连接脱氧核苷酸。 其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的温控设备等。 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 3端 2.PCR过程与结果过程与结果 (1)PCR过程 过程温度主要变化 变性 以上双链DNA解聚为_ 复性 左右 通过碱基互补配对分别与两条 结合 延伸 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸(A， T，

4、 G， C)在_ 的作用下，根据 原则合成新的DNA链 90单链 50 两种引物单链DNA 72 DNA聚合酶 碱基互补配对 (2)PCR的结果 DNA聚合酶只能特异地复制处于 的DNA序列，使这段固定 长度的序列呈 扩增。 两个引物之间 指数 问题探究 1.PCR原理 PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。 答案 答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA， 但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。 答案 答案 答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需 要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA

5、聚合酶能耐高温。 2.PCR反应过程 (1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复 制有何区别？ 答案 答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升 温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。 (2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。 答案 (3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？ 答案 答案 答案 DNA的羟基(OH)末端为3端；磷酸基团的末端为5端。当引 物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3 端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 归纳归纳 总结总结 PCR扩增与DN

6、A复制的异同 项目DNA复制PCR扩增 不 同 点 时期有丝分裂间期或减前的间期任何时期 场所活细胞内细胞外 酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的Taq DNA聚合酶 引物 有转录，产生RNA作引物，无需 人工加入 无转录，无引物产生，需人 工加入两种DNA引物 特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制 不同点 缓冲液不需缓冲液配制缓冲液代替细胞核液 设备无控制温度变化的温控设备 相同点 原理严格遵循碱基互补配对原则 引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 模板DNA的两条链为模板 特点半保留复制 原料游离的四种脱氧核苷酸 拓展应用 1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是 A.DNA聚

7、合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链 B.DNA复制不需要引物 C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合 D.PCR扩增的对象是氨基酸序列 解析 解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。 DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链。引物 通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，不 是氨基酸序列。 答案解析 2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究 的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增 所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题： (1)体内DNA复制过程

8、中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原 理是 。 答案解析 DNA的热变性原理 解析 解析 PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理 是DNA的热变性原理。 (2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。 该酶是从 中分离的。 答案解析 水生耐热细菌Taq 解析 解析 Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。 (3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。 耐高温 解析 解析 与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不 变性，具有耐高温的特性。 (4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行， 并且要严

9、格控制 条件。 解析 解析 PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶 液中进行，并需严格控制好温度条件。 一定的缓冲溶液 温度 (5)PCR中加入的引物有 种， 加入引物的作用是 。 答案解析 2 解析 解析 PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。 PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以 使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。 作为DNA复制的起点 答案 答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与 环境因素有关。 一题多变一题多变 细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH

10、吗？若需要，是如何实现的？ 答案 易错提醒易错提醒 与与PCR原理有关的三个易错点原理有关的三个易错点 (1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA 聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋 酶也作用于磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有 的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片 段的缺口，不需要模板。 (3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打 开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变 为单链，并未分解成单体。 二、PC

11、R的实验操作 基础梳理 1.实验用具实验用具 名称作用 PCR仪自动调控 ，实现DNA的扩增 微量离心管实际上是进行PCR反应的_ 微量移液器 用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种 试剂后，其上的枪头都必须_ 温度 场所 更换 2.实验步骤实验步骤 准备：按照PCR反应需要的物质和条件，将需要的试剂和仪器准备好 移液：用 按照配方在微量离心管中依次加入各试剂 混合：盖严离心管口的盖子， 用手指轻弹击 ， 使反应液混合均匀 离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在_ _ 反应：将离心管放入 中进行反应 微量移液器 管的侧壁 离心 管底部 PCR仪 3.DNA

12、含量的测定含量的测定 (1)测定原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大 小与 有关。 (2)计算方法：DNA含量(g/mL) 稀释倍数。 DNA含量 50(260 nm的读数) 问题探究 1.实验过程分析 (1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定 要盖严？ 答案 答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量 离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。 答案 (2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？ 答案 答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。 (3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲

13、液以及蒸馏水等在使用前 必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？ 答案 答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每 吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 答案 2.结果检测 (1)实验中为什么要测定DNA的含量？ 答案 答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含 量进行测定。 答案 答案 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。 电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细 程度来评价扩增的效果。 (2)如何判断DNA扩增成功？ 答案 答案 答案 样品产物少，或产生新的DNA。 (3)PCR扩增过程可

14、能会出现哪些异常结果？ 拓展应用 3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器 向微量离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集 中在离心管底部 A. B. C. D. 解析 解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于 实验台上) 移液 混合 离心 反应。PCR仪是一种自动控制温 度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。 答案解析 4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常 规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工 复制(如图)，在短时间内，将D

15、NA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使 实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。 (1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。 氢解旋 解旋 答案 (2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种 特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特 定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核 苷酸，两条子链的延伸方向都是 。 (3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件， 即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则 靠 来维持。 (4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，

16、 如果将一个用15N标记的DNA分子放 入试管中， 以14N标记的脱氧核苷酸为原料， 连续复制四次之后， 则15N标记 的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。 两 3 从子链的5端向3端延伸 温度酸碱度PCR仪 缓冲液 1/8 答案解析问题导析 问题导析问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的 原理，细胞内是在 酶的作用下解旋。 (2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有 个。 答案返回上页 热变性解旋 2 解析 解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋， 而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。 (2)

17、PCR分为三个基本反应步骤：变性(95 )、复性(55 )、延伸(72 )，其 特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的 片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头 开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从 子链的5端向3端延伸。 (3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同， 除了需要模板、 原料、 酶以外， 至 少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)， 每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。 (4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子 有2个，则15N标记的DNA分子占全部D

18、NA分子总数的比例为1/8。 返回上页 课堂小结 引 物复性 放入PCR仪 稀释调零 当堂检测 23451 1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA的解聚与结合 A.特异性 B.稳定性 C.热变性 D.多样性 答案 2.符合PCR反应条件的一项是 稳定的缓冲液环境 DNA模板 合成引物 四种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 DNA解旋酶 限制酶 温控设备 A. B. C. D. 23415 答案 解析 解析 PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可 热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。 解析 3.下列关于PCR的描述中，正确的是 PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增

19、的特异性 扩增DNA利用 了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列 A. B. C. D. 23415 答案 解析 解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把 DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶， 同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。 解析 4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物 23415 答案解析 A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环 23415 解析 解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为 模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的

20、 作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次 产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引 物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。 5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下 列问题： (1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当 引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。 23415 解析 解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团， 含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5端。引物的5端与模板链的 3端结合，然后沿

21、着引物的3端延伸。 磷酸基团 3端 答案解析 (2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了 DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离 到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq 细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。 23415 解析 解析 耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利 用选择培养基从一些微生物中分离出来。 耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基 答案解析 (3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中， 只有一个DNA片段作为模板， 请计算在5次循环后， 反应物中大约有 个这 样的DNA片段。 23415 解析 解析 PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。 变性、复性和延伸 32 答案解析 (4)简述PCR技术的主要应用：_ (要求至少答两项)。 遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、 基因克隆和DNA序列测定等