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1、-1- 课题3 3 血红蛋白的提取和分离 -2- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 1.会提取和分离血液中的血红蛋白。 2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 3.能说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。 -3- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 一、基础知识 蛋白质的各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性 质和多少、溶解度、吸附性质和对
2、其他分子的亲和力,等等,可以 用来分离不同种类的蛋白质。 1.凝胶色谱法 (1)概念:凝胶色谱法也称做分配色谱法,是根据相对分子质量的 大小分离蛋白质的有效方法。 (2)原理:大多数凝胶是由多糖类化合物构成的多孔球体,小球体 内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时, 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长, 移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的 通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质 量不同的蛋白质因此得以分离。 -4- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透
3、析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 (3)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖或琼脂糖。 (4)具体过程 蛋白质混合物上柱;洗脱开始,相对分子质量较小的蛋白质 扩散进入凝胶颗粒内;相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶 颗粒之外;相对分子质量较小的蛋白质被滞留;相对分子质量较 大的蛋白质向下移动;相对分子质量不同的分子完全分开;相 对分子质量较大的蛋白质行程较短,已从层析柱中洗脱出来,相对 分子质量较小的蛋白质还在行进中。 -5- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦
4、 目标导航 一二三 2.缓冲溶液 (1)作用:在一定范围内,能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响, 维持pH基本不变。 (2)配制:通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂 的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 3.电泳 (1)概念:带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 (2)原理:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离 的基团,在一定pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用 下,这些带电分子会向着与所带电荷相反的电极移动。电泳利用了 待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形 状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种 分
5、子的分离。 -6- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 (3)分类:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的 多少以及分子的大小等因素。而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 中,SDS能使蛋白质发生完全变性,由几条肽链组成的蛋白质复合体 在SDS的作用下会解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链 的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质 分子原有的电荷
6、量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电 泳迁移率完全取决于分子的大小。 -7- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 二、蛋白质的提取和分离 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和 纯度鉴定。 1.样品处理及粗分离 血液由血浆和各种血细胞组成,其中红细胞最多。在红细胞的组 成中,除水分以外,约90%是血红蛋白。它由四条肽链组成,包括两 条- 肽链和两条- 肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团, 此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红
7、素而呈现红色。 -8- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 (1)红细胞的洗涤 目的:去除杂蛋白。 方法:采用低速短时间离心,如500 r/min离心 2 min。 (2)血红蛋白的释放 -9- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 (3)分离血红蛋白溶液:将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中 溶液分为4层(从上往下)。 第1层:无色透明的甲苯层。 第2层:脂溶性
8、物质的沉淀层白色薄层固体。 第3层:血红蛋白的水溶液红色透明液体。 第4层:其他杂质的暗红色沉淀物。 将液体用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻 后,分出下层的红色透明液体。 (4)透析:取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12 h。 透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸)制成的,能使小分子自 由进出,而将大分子保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子质 量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。 -10- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI
9、 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 2.纯化凝胶色谱操作 处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等),因此 要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。 第一步要制作凝胶色谱柱。第二步要装填凝胶色谱柱。因为干 的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,所以装柱前需要 根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时,不能 有气泡存在。第三步是样品的加入和洗脱。 3.纯度鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求,需要进行蛋白质纯度的鉴定。 鉴定方法中使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 -11- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHI
10、SHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 三、注意事项 1.红细胞的洗涤 洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法 除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀, 达不到分离的效果,影响后续血红蛋白的提取纯度。 2.色谱柱填料的处理 商品凝胶是干燥的颗粒,使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了 加速膨胀,可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热,逐渐升温至 接近沸腾。这种方法不仅节约时间,还能除去凝胶中可能带有的微 生物,排除胶粒内的空气。 -12- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI
11、知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三 3.凝胶色谱柱的装填 装填凝胶时要尽量紧密,从而降低颗粒之间的空隙。不能有气泡 存在,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。 洗脱液不能流干,露出凝胶颗粒,否则需重新装填。 4.蛋白质的分离 分离过程中,仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果 色谱柱装填成功、分离操作正确,能清楚地看到红色区带狭窄、平 整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动;如果红色区带歪曲、散乱、 变宽,说明分离效果不好,与凝胶色谱柱的装填有关。 -13- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI
12、知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 一、血红蛋白提取和分离的过程 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,分别是样品处理、粗 分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除 相对分子质量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法 将相对分子质量较大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙 烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 特别提醒不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的。蛋 白质的来源和性质不同,其分离方法差别很大。 规律总结提取血红蛋白的实验材料要选择
13、哺乳动物的血液,因为 其红细胞中无细胞核,结构简单,血红蛋白含量高。而提取DNA的 实验材料要选择鸡的红细胞,因为其具有细胞核,含有DNA。 -14- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 二、缓冲溶液 在一定范围内,能对抗少量外来强酸、强碱或具有稍加稀释不引 起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶 液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物(缓冲剂) 溶解于水中制得的,调节缓冲剂的使用比例就可制得在不同pH范 围内使用的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持
14、反应体系的pH基本不 变。生物体内的各种生物化学反应过程都是在一定的pH下进行的, 受到氢离子浓度的严格调控。为了能够在实验室条件下准确地模 拟生物体内的过程,就必须保持体外溶液的pH与体内环境的pH基 本一致。 特别提醒透析实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量,这有 利于杂质分子充分地向外扩散。 -15- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 三、蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 -16- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUX
15、I 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 四、两种电泳方法的比较 -17- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 特别提醒(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需要 事先处理;电泳后区带易染色,样品极易洗脱,便于定量测定。 (2)测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小,而与其所带电 荷的性质和分子的形状无关。 -18- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI
16、 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 五、用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时,可 选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知相 对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置,用电泳迁移率和相对分子 质量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的相对分子质量。 特别提醒SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的成功关键之一是电泳过程 中,特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 由于用于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒 性,并且容易被皮肤吸收,因
17、此操作必须在通风橱内或通风处进行。 TEMED(四甲基乙二胺)和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、 皮肤等有很大的毒害作用,因此在进行电泳操作时一定要按照实验 要求和步骤,在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。 -19- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二题型三 题型一 凝胶色谱法的原理与操作 【例题1】 利用凝胶色谱法分离蛋白质时,什么样的蛋白质先洗 脱出来?( ) A.相对分子质量较大的 B.溶解度高的 C.相对分子质量较小的 D.所带电荷多的 解析:相对分子
18、质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道,路程较 长,移动速度较慢;相对分子质量较大的蛋白质,路程较短,移动速度 较快,首先洗脱出来。 答案:A 反思领悟凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法。 -20- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二题型三 题型二 电泳技术的原理与操作 【例题2】 下列关于电泳的说法,错误的是( ) A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于
19、它所带净电荷的 多少 D.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时,蛋白质的电泳迁移 率完全取决于分子的大小 -21- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二题型三 解析:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷 的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质- SDS复合物,SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异,使SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳中蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案:C 反
20、思领悟电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以 及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度, 从而实现样品中各种分子的分离。 -22- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二题型三 题型三 蛋白质的提取和分离 【例题3】 下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述,正确的 是( ) A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤,其目的是去除细胞表面杂蛋白 B.将血红蛋白溶液进行透析,其目的是去除相对分子质量较大的 杂质 C.血红蛋白释放时加入有机溶剂,其目的是使血红蛋白溶于有机 溶剂 D.分离蛋白质的过程中不断用磷酸缓冲液处理,是为了维持血红 蛋白的结构 -23- 课题3 血红蛋白的提取和分离ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二题型三 解析:红细胞的洗涤用的是生理盐水,其目的是去除血浆蛋白等 杂质,有利于后续步骤的分离纯化;而本实验中蒸馏水的作用是涨 破红细胞,使血红蛋白释放。将血红蛋白溶液进行透析,其目的是 去除相对分子质量较小的杂质。血红蛋白释放时加入有机溶剂,其 目的是溶解细胞膜。分离蛋白质的过程中不断用磷酸缓冲液处理, 是为了维持血红蛋白的结构。 答案:D