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1、-1- 课题2 2 多聚酶链式反应扩增DNADNA片段 -2- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 1.能进行PCR技术的基本操作。 2.能记住PCR的原理。 3.能说出PCR的应用。 -3- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 一、PCR原理 1.细胞内DNA复制所需基本条件 DNA分子能准确复制的原因有哪些? 提示:DNA双螺旋结构提供模板;碱基
2、互补配对。 -4- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 2.子链延伸的方向 (1)DNA的两条链是反向平行的,通常将DNA的羟基末端称为3端, 而将磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成 DNA,而只能从3端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。 (2)DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 3.DNA分子复制的人工控制 (1)双链的解开是进行DNA复制的前提。在体外可通过控制温度 来实现。在80100 的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,
3、双 链分开,这个过程称为变性。 (4)高温可以打开DNA双链,但会导致普通的DNA聚合酶失活。 后来耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效 率。 -5- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 (3)PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解 聚与结合。 (4)由于PCR过程的温度高,会导致普通的DNA聚合酶失活,后来 耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效率。 (5)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,
4、需提供:DNA模 板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的 DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 -6- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 二、PCR的反应过程 1.PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性 和延伸三步。 2.在循环之前,常要进行一次预变性,以便增加大分子模板DNA彻 底变性的概率。 3.过程 (1)变性:当温度上升到90 以上时,双链DNA解聚为单链。 (2)复性:当温度下降到50 左右时
5、,两种引物通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 (3)延伸:当温度上升到72 左右时,合成新的DNA链。 4.从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并 且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合,进行DNA的延 伸,这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序 列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。 -7- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 三、实验操作 在PCR实验中,通常要用到微量离心管。具体操作时,用微量移液 器依次加入各种组分
6、。 -8- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 四、实验注意事项 1.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用微量离心管、 枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 2.缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 储存。 3.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种成分后,移液器上 的枪头都必须更换。所有成分加入后盖严离心管口的盖子。 4.混匀后要离心处理,使反应液集中在离心管底部,再放入PCR仪 中进行反应。 你知道怎样获得大量的乙肝病毒基因吗? 提示:采
7、用PCR技术对乙肝病毒基因进行迅速扩增。 -9- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 一二三四五 五、DNA含量的测定 1.理论上DNA扩增呈指数增长,即一条DNA片段循环n次后产物 DNA的数目为2n,但实际可能会有诸多因素影响DNA含量,所以需 要对DNA含量进行测定。 2.DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与 DNA的含量有关,可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。 -10- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识
8、梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR) -11- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 -12- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二 题型一 PCR的原理及应用 【例题1】 下列关于PCR的描述,错误的是( ) A.PCR技术的原理是DNA复制 B.PC
9、R是一种酶促反应,需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶 C.一个DNA片段经PCR扩增,理论上可以形成2n个DNA片段(n代 表循环次数) D.PCR利用DNA的热变性原理来控制DNA的解聚与结合 解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量的 DNA为模板,DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸,短时间内 迅速复制上百万份的DNA拷贝。PCR利用DNA的热变性原理来解 旋,不需要解旋酶。 答案:B -13- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二 反思领悟DN
10、A复制时要解螺旋,细胞内DNA的解旋需要解旋酶 催化,而体外DNA复制时一般是加热解旋。 -14- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二 题型二 PCR技术操作 【例题2】 在PCR实验操作中,下列说法错误的是 ( ) A.在微量离心管中添加各种试剂时,只需一个枪头 B.离心管的盖子一定要盖严,防止液体外溢 C.用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合 D.离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果 解析:在微量离心管中添加各种试剂时,每吸取一种试剂后,移液 器上的枪头必须更换,以确保实验的准确性;离心管的盖子一定要 盖严,防止实验中脱落或液体外溢;离心的目的是使反应液集中在 离心管底部,提高反应效果。 答案:A -15- 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI 知识梳理 DIANLITOUXI 典例透析 ZHONGNANJUJIAO 重难聚焦 目标导航 题型一题型二 反思领悟(1)为避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水 等使用前应进行高压灭菌。 (2)缓冲液和酶应分装成小份,-20 低温保存。 (3)每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。 (4)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。