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1、1,GPC基础知识,2,SEC定义,SEC全称Size Exclusion Chromatography(体积排阻色谱，或者尺寸排阻色谱） SEC定义：是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法。,3,SEC分类,凝胶渗透色谱 (GPC) 主要用于聚合物领域 以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF) 常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物 凝胶过滤色谱 (GFC) 主要用于生命科学领域 以水溶液为流动相 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等),4,GPC用途,高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本的参数之一。高聚物的许多性
2、质是与分子量有关的。例如冲击强度、模量、拉伸强度、耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量和分子量分布有关。,5,GPC分离原理,固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部 样品与固定相之间无作用力 迁移时间不同,6,MW与RT之间的关系,Log (MW),排阻极限,渗透极限,GPC柱,7,GPC术语,排阻极限 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60
3、106之间。 渗透极限 能够完全进入凝胶颗粒孔穴内部的最大分子的分子量。 在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。,8,平均分子量计算公式,数均分子量 重均分子量 Z均分子量 Z+1均分子量 Hi： 峰高 Mi：分子量,Mz+1 =,Mi 3Hi,S Mi 2Hi,9,平均分子量含义,数均分子量 (Mn) 拉力、抗冲击性 重均分子量 (Mw) 脆度 Z 均分子量 (Mz) 弹性、硬度 分布宽度指数D(分散度)= Mw/Mn 对于多分散试样 Mn Mw Mz,10,高聚物多分散性表征,样品间分子量分布宽度的比较，最直接的方法是将实验所得到的分子量分布曲
4、线作对比。 分子量分布曲线有两种形式： 用重量分数W对分子量作图的曲线叫做微分分布曲线； 用累积重量分布对分子量作图的曲线叫做积分分布曲线。 还有一种更一般化且最常用的方法就是重均数均比，即：Mw/Mn。,11,测定聚合物分子量的方法,直接方法 渗透压方法 (for Mn) 光散射方法 (for Mw) 粘度方法 (for Mv) 超速离心方法 (for Mz) 间接方法 GPC (for Mn, Mw and Mz) 用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出聚合物样品的相对分子量。如和标准品结构不同，还需进行相应的计算才能得到聚合物样品自身的分子质量。,12,为什么要用GPC方法,相对分子量
5、分布(多分散性指数)对聚合物的性质有重要影响。 在相对分子质量分布（多分散性指数）成为人们关注的热点后，经典方法却不能同时测定聚合物的相对分子质量分布。凝胶渗透色谱(GPC)的应用改善了测试条件，并提供了可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分布的方法，使其成为测定高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。,13,GPC系统配置,需要GPC软件才可计算MW,14,配置实例,15,GPC系统与常规HPLC系统区别,检测器 GPC系统标配示差折光检测器 常规HPLC有多种检测器可选 梯度 GPC系统是等度系统，并且用并联泵 常规HPLC可以是等度或者梯度 管路 GPC系统采用全不锈钢流路
6、常规HPLC用PEEK或者不锈钢流路 自动进样器针密封 GPC系统采用Vespel针密封，适用THF、氯仿、DMF等 常规HPLC用PEEK针密封,16,LCsolution GPC软件,该 GPC 可选软件可在 LCsolution 上无缝地运行。作为 LCsolution 的一部分，此软件扩展了方法、数据和报告格式文件的功能，并可使用 LCsolution 的所有功能特性。,特点： 1) 可以操作 GPC 与 LC 工作站 2) 对方法和数据文件的统一管理 3) 兼容多个系统和多个检测器（包括 PDA 检测器） 4) 同时输出色谱图报告和 GPC 计算结果 5) 可以根据控制样品进行保留时
7、间的校准,17,GPC色谱柱系列,Shim-pack GPC-80X for THF Shim-pack GPC-80XC for 氯仿 Shim-pack GPC-80XD for DMF 排阻极限 (聚苯乙烯) 1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802), 2x104(GPC-8025), 7x104(GPC-803), 4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-806)，4x107 (mixed gel，GPC-80M), 2x108(GPC-807),18,GPC色谱柱类型,普通凝胶柱 按照不同的排阻极限分成很多种型号(如
8、GPC-80X) 每种排阻极限的柱子使用同一种凝胶颗粒 在一段范围内校正曲线成线性 混合凝胶柱 一种型号(如GPC-80M) 使用混合凝胶颗粒 在较宽范围内校正曲线都成线性，可消除不同柱子串联时可能产生非线性校正曲线导致结果偏差的问题,19,GPC色谱柱类型,混合凝胶柱GPC-80M,20,GPC色谱柱选择,按照样品所溶解的溶剂来选择柱子所属系列 THF、氯仿、DMF 必须选择合适的溶剂来溶解聚合物 按照样品分子量范围来选择柱子型号 样品分子量应该处在排阻极限和渗透极限范围内，并且最好是处在校正曲线线性范围内,21,标样,聚苯乙烯(PS，溶于各种有机溶剂) 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 聚环氧
9、乙烷 (PEO，也叫聚氧化乙烯，溶于水) 聚乙二醇(PEG，溶于水) (PEO与PEG的碳链骨架相同，但是其合成原料和封端不同，由于原料的性质，使其产物的分子量和结构都有一定的区别。PEO常是指一端为甲基封端，一端为羟基封端的聚环氧乙烷，而PEG一般是两端都是羟基封端的聚乙二醇。),22,校正曲线,逐一注入聚合物标样以确定分子量与保留时间的关系,常用线性拟合或者三次方拟合,23,GPC校正方法,窄分布标样校正法 选用与被测样品同类型的单分散性(d1.1)标样，先用其他方法精确测定其平均相对分子质量，然后与被测样品在同样的条件下进行GPC分析。 普适校正法 此法的优点是只要用一种高聚物（一般用窄
10、分布聚苯乙烯）作标准曲线就可以测定其他类型的聚合物，但先决条件是2种高聚物的K和值必须己知。 渐进试差法(宽分布标样校正法) 这种方法不需要窄分布样品，其标样可为13个不同相对分子质量的宽分布标样（平均相对分子质量精确测量，Mw和Mn为已知），采用数学处理方法得到渐进试差法的校正曲线。,24,窄分布标样校正法,要有5个以上的不同分子量的单分散标样来制作校正曲线 样品最好与标样是相同的结构。 如果样品与标样结构完全一样，则结果不需再修正 如果样品结构与标样结构不一样，并且样品是单链结构，则可以用QF因子比来修正结果 如果样品结构与标样结构不一样，并且样品带有支链，则无法使用窄分布标样校正法,25
11、,窄分布标样校正法-分子量转换,QF因子比(RQF) QF定义：单位链长分子量 仅适用于单链聚合物,26,聚苯乙烯的QF,QF=104 / 2.50 = 41.5 -( CH-CH2 )n- C6H5 单位链长的MW = 104 一个单位长度为 2.50 A. C-C 键长度约为 1.54 A. C-C-C 键角度约为 109度. 一个单位长度计算如下： 1.54 x sin(109 / 2) x 2 =2.50,27,聚苯乙烯的QF,C,C,C,C,109,1.54 A,1.54 x sin (109/2),1.54 x sin (109/2) x 2,2.50 A,C,C,28,聚异丁烯的
12、QF,QF = 56 / 2.50 = 22.3 CH3 -(C-CH2)n- CH3 单位链长的MW = 56 一个单位长度为 2.50 A.,29,RQF,聚异丁烯与聚苯乙烯的QF之比为 RQF. RQF = 22.3 / 41.5 = 0.537 M 聚异丁烯= M GPC x 0.537,30,RQF的制约因素,RQF 仅适用于单链聚合物 如果聚合物有支链结构, MW的计算就有误,31,普适校正法,用一种高聚物标样做校正曲线，常用聚苯乙烯 样品结构可以与标样不一样，并且可以有支链 样品及标样在流动相溶剂中的K和值必须己知 可以用粘度法来测定K和的值,32,普适校正法公式,GPC反映的是
13、淋洗体积与高聚物流体力学体积间的关系。根据Einstein粘度关系： 为特性粘度；v表示聚合物链等效的流体力学体积；N为阿佛加德罗常数；M为聚合物分子量。 根据上式可用M表示流体力学体积。,33,普适校正法公式,当样品与标样有相同的淋洗体积时，下式成立： 式中下标1为标样参数，2为样品参数。 将Mark-Houwink方程(=KM)代入，即得到： 从而得出：,34,渐进试差法(宽分布标样校正法),不需要窄分布标样，只需要宽分布标样 标样和样品为同一种物质 标样数量最少可以只有1个 标样的分子量Mw和Mn必须已知 标样校正曲线呈线性,35,渐进试差法(宽分布标样校正法),在一定条件下，有： (1
14、) 将标样色谱峰分成若干个切片，则： (2) 根据定义，有： (3) (4) 将公式(2)代入公式(3)和(4)，则： (5) (6) 标样的Mw和Mn已知，将Hi,Vi代入，软件自动算出A,B值。,36,GPC分析大致步骤,根据样品的特点选择合适的GPC柱子和标样，并且确定采用的GPC校正方法 配制标样和样品，用LCsolution进样得到色谱图 用LCsolution GPC生成校正曲线并计算样品平均分子量，制作报告,37,GPC系统安装注意事项,安装色谱柱 柱子串联时排阻极限大的接前面 管路选择 使用全不锈钢流路，不能有PEEK材质的部件存在 溶剂更换 水和氯仿不互溶 最高压力设置 柱子
15、串联时将最高压力设为所有柱子允许承受的最高压力之和 柱子使用注意事项 一定要严格按照说明书使用色谱柱(部分柱子不能用甲醇冲洗)氯仿柱子要用氯仿冲洗柱子，THF柱子要用THF冲洗，氺相柱子一般用60水40乙腈保存,38,安装色谱柱,通常而言，分析结果与色谱柱组安装的顺序无关。尽管如此，为了提高分离度和延长色谱柱寿命，应按孔径由大到小顺序安装色谱柱，即排阻极限大的接前面，排阻极限小的接后面。 原因在于，孔径越大，越粗糙，越能承受外来物质的积累污染。而且，样品中高分子量的物质对样品的粘度影响最大。如果大分子先被分离，粘度下降更快，对色谱柱的压力降低。,39,GPC分析注意事项,如何配制标样和样品 系
16、统平衡 柱子冲洗及保存 校正曲线有效时间 亲水性聚合物分析,40,GPC标样配制,由于凝胶色谱中浓度检测通常使用示差折光检测器，其灵敏度不太高，所以试样的浓度不能配置得太稀。但另一方面色谱柱的负荷量是有限的，浓度太大易发生“超载”现象。 一般情况下，进样浓度按分子质量大小的不同在0.050.5%（质量分数）范围内配置。分子质量越大，溶液浓度越低。 标样配制应该严格按照标样说明书进行。通常室温静置12小时以上，然后轻轻混匀。绝对不能超声或者剧烈振荡来加速溶解。 溶液进样前应先经过过滤，以防止固体颗粒进入色谱柱内，引起柱内堵塞，损坏色谱柱。,41,GPC标样配制,一种分子量的标样进样一次得到标样色
17、谱图，这样的结果是最理想的。通常，为节约时间，可以将分子量相差较大(峰不会重合)的两种标样配制在一个瓶中，然后进样，可以节约一半的标样分析时间。 如8个不同分子量的标样可以按右表编成4组分别进样。,42,进样浓度范围及体积,分子量范围 样品浓度 低于5,000 1.0% 5,00025,000 0.5% 25,000200,000 0.25% 200,0002,000,000 0.1% 高于2,000,000 0.05% 进样体积 50-100uL之间(浓度在0.05%-0.5%之间),43,GPC系统平衡,安装色谱柱之前，用两通管连接管路，用流动相替换系统后换上GPC柱子。(注意溶剂互溶情况
18、) RID平衡操作 分析开始前，用流动相冲洗检测器流路。 流动相流速1ml/min，切换到R Flow，使流动相通过检测池的样品池和参比池，冲洗20min左右。 然后切换R Flow 流路数次，将气泡赶出检测池。 关闭R Flow，等待基线平稳。 当Balance 值高于50，进行Balance 调整。 色谱柱平衡 等溶剂峰出峰后在经过约一次分析时间后基线才能走平。,44,GPC柱子冲洗及保存,如果在24h内再次使用色谱柱，无需特别的处理步骤。如果长时间不使用，应用保存溶剂冲洗色谱柱，拆下色谱柱，上紧堵头，放入色谱柱盒子中保存。 严格按照柱子说明书中允许条件下使用。 避免振动和机械撞击。 专柱
19、专用，经常改变样品和溶剂会加速色谱柱恶化，降低分离度。,45,GPC校准曲线有效时间,每周用标样评价标准曲线，如果偏差大于0.10M（10%），重做标准曲线。 更换色谱柱后，需重做标准曲线。,46,亲水性聚合物分析注意事项,使用亲水性 GPC 柱 Shodex OHpak SB-800 HQ series TOSOH TSK-GEL PW series 使用葡聚糖，聚乙二醇和聚氧化乙烯作为标准物 使用盐如(50mmol/L) NaCl, NaNO3, LiCl 等以消除离子间引力 使用有机溶剂如甲醇、乙腈等以消除疏水性作用力,47,GPC分析例,色谱柱：Shodex GPC KF-804,80
20、2,801三根串联 保护柱：Shodex GPC KF-G 流动相：THF 流 速：1.0ml/min 柱 温：50 进样量：50ul 检测器：示差折光检测器RID-10A 标准品：PS(聚苯乙烯）(8个不同分子量标样),48,标准品及样品配制方法,分子量校准曲线所用的标准品为PS，有8种不同分子量的标品。将它们按下表分为4组，每组含2种标品，各称约4mg左右，然后用20ml流动相溶解，配成4个标样。 称量5mg样品，加入4ml流动相溶解过夜。,49,标样图谱,四种颜色分别表示四个标样的图谱,50,分子量校准曲线,51,样品分析结果,52,PS1和PS2为同一操作人员测定同一样品的两次测定结果
21、 PS3为另一实验室对同一样品测得的结果,结果评价示例,53,重复性考察对于数均分子量同一操作人员两次测定值之差，不应超过式（1）的数值r m ： r m= 0.10Mn平均 （1）式中：Mn平均表示数均分子量的平均值。 对于多分散系数同一操作者两次测定值之差，不应超过式（2）的数值r D ： r D=0.06D （2）式中：D表示多分散系数测定值的平均值。 r m=0.10（72645+71965）/2=7231 Mn（室内）=Mn2-Mn1=72645-71965=680（0.0094） r D=0.06(1.032+1.041)/2=0.062 D （室内）=D 2-D 1=1.041-
22、1.032=0.009（0.0086） 对于样品PS，同一操作者两次数均分子量测定值之差M n小于r m；多分散系数之差D 小于r D，实验的重复性很好。,数均分子量和多分散系数重现性,54,对于数均分子量，两个实验室各测一次的结果之差，不应超过式（3）的数值R Mn ： R Mn=0.25 Mn平均 （3） 式中：Mn平均表示数均分子量测定值的平均值。 对于多分散系数，两个实验室提出的结果之差，不应超过式（4）的R D ： R D=0.15D （4） 式中：D表示多分散系数测定值的平均值。 Mn （室间）=72645-70985=1660（0.092） R Mn=0.25 Mn平均 =0.25（72645+70985）/2=17954 D （室间）=1.041-1.032=0.009 R D=0.15（1.041+1.033）=0.311（0.0087） 对于样品PS，两个实验室间检测的数均分子量之差小于R Mn，多分散系数之差小于R D，实验的再现性很好。,数均分子量和多分散系数再现性,