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1、细胞培养室的建立与环境设计 细胞培养室是提供细胞生物学研究的基础实验室，有 500m 2 的实验场地， 拥有 4 个层 流的细胞操作间、6 个普通培养操作间，及配套实验室和洗涤消毒室。 主要设备：超净工作台10 台， forma 细胞培养箱7 台，普通倒置显微镜8 台，普通生物显 微镜 5 台，荧光显微镜-正置、倒置 -各 1 台及照相系统一套（OLYMPUS ），显微摄象和 采图及分析系统1 套， sigma 离心机 1 台， sigma 低温离心机1 台，程序降温仪1 台及相 应的配套设备。 细胞培养室24 小时开放，定期定时室内消毒灭菌。细胞培养室除提供细胞培养所需要的各 种工具、生物学
2、试剂及细胞储藏,洗涤、消毒服务外，还提供技术指导、咨询，定期为广大 科研工作者开设技术讲座，开展技术经验交流活动。 宽敞的细胞培养区 普通细胞培养室内走廊 普通细胞培养室一角 万级层流细胞培养室 一、建细胞间的一些细节问题： 1、甲醛薰蒸： 40甲醛溶液 (药用规格、福建三明化工总厂出品)，用量 30 ml m3，室内温度21 24， 相对湿度75 85，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗1 h 。 甲醛水溶液为无色，具有强烈刺激性气味的液体，可杀灭多数微生物，价廉，熏蒸消毒时不 损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含3740% 的甲醛。其主要用 法为： （1）熏蒸消毒:对室内消
3、毒其用量为2025% 毫升 /米，在加热该溶液时最好同时煮沸 一壶水，使室内相对温度保持在70-90% 左右，室内温度最好在20 摄氏度以上，作用时间 12-24 小时。如消毒皮毛服装，甲醛水溶液的用量可加至125 毫升 /米,挂衣密度为每平方米 3 套为宜。熏蒸消毒时应密闭门窗。消毒后一般多用自然通风驱散甲醛气体，其需时较长， 急于排出气体，可将25% 氨水加热蒸发中和。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，中和时 间为 30 分钟。 （2）自然挥发 : 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中，室内温度保持在18 摄氏度以 上，同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上，经16 小时可达到室内消毒的目的
4、。 关于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比较：甲酸的毒性比甲醇大6 倍，甲醛的毒性比甲醇大 30 倍。所以吃进410 克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表现在损伤视力， 使视力减退（不能矫正），视野缩小，以致双目失明，直到死亡。 2、关于紫外线： 紫外线的穿透能力非常弱的，主要靠电离产生氧自由基来消毒。细胞培养室里面一些不能照 射紫外的物件可以用一般的材料盖住。如：玻璃和有机玻璃都可以的。紫外有些人认为大型 精密的显微镜是不可以照紫外的，因为它们的镜头上涂的膜会被分解掉，但我特意问了我校 光学系的老师，他们认为是没有关系的。 此外， 不要担心紫外不能照射到的角落，因为紫外杀菌功能除了紫外本身
5、以外，还可以由产 生的臭氧来完成。 臭氧过量吸入的作用应该和双氧水的作用是一样的，个人认为也许有一定的致癌性。所以紫 外灭菌以后，最好过一个小时再进去。 3、关于新洁尔灭： 【药品名称】苯扎溴铵溶液(新洁而灭溶液 ) (乙类非处方药【别名】 BenzalkoniumBromideSolution【标准来源】 中华人民共和国药典2000 年版。 【性状】 无色或淡黄色的澄明液体;芳香 ;味极苦 ;强力振摇能发生多量泡沫，遇低温可能发生浑浊或沉 淀。【药物组成】每毫升含苯扎溴铵0.05 克 (5%) 。【作用类别】皮肤科用药品。【药理 作用】 苯扎溴铵为阳离子表面活性剂类广谱杀菌剂。【临床应用】用
6、于皮肤黏膜和伤口的消 毒。【用法用量】外用，使用前应稀释即配即用。皮肤消毒使用0.1%溶液；创面黏膜消毒 用 0.01% 溶液；稀释方法： 0.1% 溶液：取本品一份，加纯化水或清水50 份； 0.01% 溶液： 取本品 1 份，加纯化水或清水500 份。【注意事项】l. 本品为外用消毒防腐药，不可内服。 2. 不得用塑料或铝制容器贮存。3. 涂布部位如有灼烧感、瘙痒、红肿等，应停止用药，洗 净。必要时向医师咨询。4. 低温时，可能出现混浊或沉淀，可置于温水中加温，振摇使溶 解后使用。 5. 儿童必须在成人监护下使用。【不良反应】 偶见过敏反应。【药物相互作用】 l. 不得与肥皂或其他合成洗涤
7、剂并用。2. 局部消毒时勿与碘酊、高锰酸钾、双氧水、磺胺 粉等并用。3. 如正在使用其他药品，使用本品前请咨询医师或药师。【规格】 500 毫升 25 克； 100 毫升 5 克(5%) 。【贮藏】避光，密封保存。 评论：在甲醛灭菌前，先用新洁尔来擦洗整个墙面，此外，平时地板灭菌也可以用它。新洁 尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml 只需 5 元，而且可以稀释50 倍 用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。 二、培养准备时的一些问题： 1、多聚赖氨酸： 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Conc.: 0.1% w/v, in water
8、 Storage: 18-26 Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴 离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理， 以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 使用说明 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1 灭菌的 ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。 2 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26 3 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5 分钟。注意
9、增加时间不会提高包被效果。 4在 60烘箱 1 小时干燥，或室温18-26 过夜干燥待用。 注意 1 每 100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90 张， 超过 90 张片子将影响其 黏合力。 2 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl 的 70%乙醇溶液来清洗。 3 不要在用过的稀释液中加新的溶液。 4 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8，至少在3 个月内是稳定的。 5 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。 2、洗液的一些问题： 重铬酸钾硫酸洗液 通常称为洗洁液或洗液，其成分主要为重铬酸钾与硫酸,是强氧化剂。 K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4 Cr2(S
10、O4)3 3O 因其有很强的氧化力，一般有机物如血、尿、油脂等类污遗迹可被氧化而除净。事先 将溶液稍微加热，则效力更强。新鲜铬酸洗液为棕红色，若使用的次数过多，重铬酸钾就被 还原为绿色的铬酸盐，效力减小，此时可加热浓缩或补加重铬酸钾，仍可继续使用。 配方：稀洗液重铬酸钾10g 粗浓硫酸200ml 水 100ml 浓洗液重铬酸钾20g 粗浓硫酸350ml 水 40ml 配法：先取粗制重铬酸钾20g，放于大烧杯内，加普通水100ml 使重铬酸钾溶解（必 要时可加热溶解）。再将粗制浓硫酸（200ml ）缓缓沿边缘加入上述重铬酸钾溶液中即成。 加浓硫酸时须用玻璃棒不断搅拌，并注意防止液体外溢。若用瓷桶
11、大量配制，注意瓷桶内面 必须没有掉瓷， 以免强酸烧坏瓷桶。配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产 生大量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。 使用时先将玻皿用肥皂水洗刷12 次,再用清水冲净倒干,然后放入洗液中浸泡约2 小 时,有时还需加热 ,提高清洁效率。经洗液浸泡的玻皿，可先用自来水冲洗多次，然后再用蒸 馏水冲洗12 次即可。 附有蛋白质类或血液较多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可对有如酒精、 乙醚的容器用洗液洗涤。 洗液对皮肤、衣物等均有腐蚀作用，故应妥善保存。使用时带保护手套。为防止吸收 空气中的水分而变质，洗液贮存时应加盖。 注意： 洗液具有强烈的腐蚀性，接触皮肤
12、后会，皮肤会变黄，2 天后会脱一层皮。 3、氟尿嘧啶： 别 名：5氟尿嘧啶英 文 名：Fluorouracil (5 FU)。作用与用途： 本品为嘧啶类的氟化物， 属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶 核苷核，干扰DNA 合成。对RNA 的合成也有一定的抑制作用。 操作：在神经元培养时可以用来抑制胶质的生长。 4、L-谷氨酰氨： 资料： 氨基酸是组成蛋白质的基本单位.不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细 胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸.其中谷氨胺是细胞合 成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞
13、生长不良而死亡.因此 ,各种培养液中 都有较大量的谷氨酰胺.但是 ,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于 -20冰箱中保存,在 使用前加入培养液内.已含谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2 周以上时 ,还应重新加入原 来量的谷氨酰胺. 细胞培养实验室环境设计 1 实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害 因素的影响 .细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁, 空气清新 ,干燥和无烟尘.细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内 侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室. 2 常用设施及设备 (1
14、)超净工作台 :也称净化工作台,分为侧流式 ,直流式和外流式三大类. (2)无菌操作间 :一般由更衣间 ,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化 碳培养箱 ,离心机 ,倒置显微镜等 .缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等. (3)操作间 :普通培养箱 ,离心机 ,水浴锅 ,定时钟 ,普通天平及日常分析处理物 (4)洗刷消毒间 :烤箱 ,消毒锅 ,蒸馏水处理器及酸缸等. (5)分析间 :显微镜 ,计算机及打印机等. 3 培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶,培养板 ,培养皿等 .常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度 好,无毒 ,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯
15、乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常 用的器皿有下面几种. (1)液体储存瓶 :用于储存各种配制好的培养液,血清等液体 ,常用规格有500ml,250ml, 100ml 等几种 . (2)培养瓶 :根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶 壁厚簿均匀 ,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm, 允许吸管伸入 瓶内任何部位 ,规格有 200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等几种 . (3)培养皿 :用于开放式培养及其它用途.分直径 30mm,60mm,120mm等几种 . (4)吸管 :常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管
16、.其改良后管上部有球型刻度称 改良吸管 ,刻度吸管用于移动液体.常用 1ml 和 10ml 两种 .短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种. (5)离心管 :离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细胞培养 的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类.前者分别为50ml,30ml,15ml;后者则 多为 10ml 和 5ml. (6)其它 :如三角烧瓶 ,烧杯 ,量筒 ,漏斗 ,注射器等 . 4 细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同. 人体细胞培养的标准温度为36.5 0.5 ,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受
17、到影响, 甚至死亡 .培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39时 ,细胞代谢与温度成 正比 ;人体细胞在39-40 1 小时 ,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在 40-41 1 小时 ,细胞 会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42 1 小时 ,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡, 个别细胞仍有恢复可能;当温度在 43以上 1 小时 ,细胞全部死亡.相反 ,温度不低于0时 ,对 细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35 时 ,细胞仍能生存和生长,但速度减 慢;放在 4数小时后 ,再回到 37培养 ,细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢.当温 度降至冰点以
18、下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是 ,如果向培养液中加入一定量的冷冻 保护剂 (二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80 或 -196 (液氮 )长期保存 . 5 合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三 羧酸循环 ,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一 般把细胞置于95% 空气加 5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细 胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值.大多数细胞的适 宜 pH 为 7.2-7.4, 偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些, 在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合 pH 是 7.4-7.6. 每种细胞都有其最适pH 值.