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1、激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ） 生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水 平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构 和功能的分析检测 Conventional fluorescence microscope Confocal microscope 历史 1957年，Marv
2、in Minsky 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美 国的专利。 1967年，Egger 和 Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 1977年，Sheppard 和 Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性 关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为 SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年 MRC-500 型改进为光束扫描，用作生 物荧光显微镜的共聚焦系统。 Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Na
3、ture 328, 183 -184 (09 July 1987 Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜 Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜 Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜 Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜 Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜 国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜 Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜 基本原理 相差、 DIC 常用荧光标记 共聚焦原理 Two ways to obtain contrast in
4、light microscopy. The stained portions of the cell in (A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them. A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little
5、change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase- contrast or a different
6、ial-interference-contrast microscope. D. Phase-contrast or a differential-interference- contrast microscope Four types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other ima
7、ges were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy. 常用荧光探针 Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles 荧光显微镜原理 明场：透射 荧光：落射 落射的优点：
8、 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。 激发光损失小，荧光 效应高。 共聚焦原理 由于 pinhole 的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT 探测器探测 到，从而提高了成像效果。通过对样品在 x-y 方向上的逐点扫描，可以形成二维 图像。如果调解焦平面在z 方向的位置，连续扫描多个不同z 位置的二维图像，则 可以形成一个 3D 图像， 3D 的重建需要软件的支持。 The unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It contains motorized collimators, scanning mirro
9、rs,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectors including the META detector. All these components are arranged to ensure optimum specimen illumination and efficient collection of reflected or emitted light. A highly efficient optical grating provides an innovative
10、 way of separating the fluorescence emissions in the META detector. The grating projects the entire fluorescence spectrum onto the 32 channels of the META detector. Thus, the spectral signature is acquired for each pixel of the scanned image and subsequently can be used for the digital separation in
11、to component dyes. 分光镜组件结构 共聚焦构成 ? 光学显微镜 ? 激光光源 ? 扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜）?光检测器 ? 计算机系统（数据采集、处理、转换应用）?图形输出设备 LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 图像相关概念 RGB 三基色 图像数据位 亮度 对比度 饱和 分辩率 怎样得到样品图像 样品的标记物有合适的激发波长和发射波长荧光下观察选择合适的图象 设置激光扫描的通道参数 设置图象的属性 调节每一个通道的亮度、对比度、清晰度、背景亮度 启动 共聚焦和 CCD 照片的比较 更大的动态范围 高灵敏度 图像背景的消除 灵活的拍照区域选择 ZOO
12、M 功能 伪彩色 环境要求高 多通道图象合成 时间序列 Ca 离子成像 FRAP ：Fluorescence Redistribution After Photo bleaching FRAP 是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某 一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的 速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测, 因而可得到活 细胞的动力学参数。 LSCM 可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速 率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子 迁移率，细胞间通讯等领域。 荧光漂白恢复（ FRAP ） 人卵细胞的局部光漂白 FRAP 研究 ER-GFP 的核转位