环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解.pdf

《环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展讲解.pdf（11页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年增刊 技术与方法 核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段,其中 PCR技术最为常 用。但在应用过程中人们发现PCR技术存在一些不足 ,如靶基因易被污染 ,可能引起 非特异性扩增 ,多种因素可以产生抑制扩增反应,扩增反应时间较长 ,一般需要几小时 , 需要比较昂贵的 PCR仪,不利于在基层实验室推广应用等。2000年,日本学者 Notomi 等1建立了一种新的核酸扩增方法 环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP 技术,该技术克 服了 PCR技术的一些缺点

2、。目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等 病原体的检测中取得重要进展,在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。 1LAMP 技术原理 LAMP 技术依赖于能够识别靶序列上6个独立区域的两对特异性引物(内引 物:FIP和 BIP;外引物 :F3和 B3 和一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA 聚 合酶,在等温条件下可高效、特异的扩增靶序列。LAMP 反应过程是先由外部引物 扩增出内部引物扩增所需要的模板,即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引 导合成靶基因 DNA 片段,由于内部引物扩增的DNA 片段含有与该引物5 端 DNA 片段的反向互补序列 ,因而这些反向互补序列之间通过

3、杂交形成茎环结构,另外一条 内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应,在扩增的 DNA 片段的另外一 端产生了新的茎环结构 ,形成哑铃状结构 ,如此往复循环最后形成花椰菜形状的茎 环结构的 DNA,数量级可达 1091010拷贝,电泳后可见扩增终产物由大小不 等的 DNA 片段组成 ,呈梯状条带。 LAMP 反应体系和 PCR反应体系相似 ,即由模板、引物、聚合酶、dNTP 和缓 冲液组成。但 LAMP 使用四个引物 ,聚合酶为 Bst DNA 聚合酶。 LAMP 扩 环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展 郑洋妹 1 陈信忠 2 (1福建农林大学动物科学学院,福州 350002;2厦门

4、出入境检验检疫局 ,厦门 361026 摘要:综述了环介导等温扩增技术检测病毒、细菌和寄生虫等动物病原方面的 研究和应用最新进展。 关键词 :环介导等温扩增技术病原检测进展 Progress in Detecting Animal Pathogens by Loop-mediated Isothermal Amplification Zheng Yangmei1Chen Xinzhong2 (1The Zoo-science Institute of Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2Xiamen Entry-E

5、xit Inspection and Quarantine Bureau,Xiamen361026 Abstract:This article summarized the newest progress on the research and application in detecting virus,bacterium and parasite by loop-mediated isothermal amplification. Key words:Loop-mediated isothermal amplification Pathogens Detection Progress 收稿

6、日期 :2009-03-13 作者简介 :郑洋妹(1985-,女,硕士研究生 ,研究方向 :动物病原与分子生物学研究 通讯作者 :陈信忠(1964-,男,研究员 ,主要从事水生动物病害研 究;Email: 2009年增刊郑洋妹等 :环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展 增操作简便 ,反应体系混匀后于6065恒温反应 1h,移至 80热浴 10min 灭 活 Bst DNA 聚合酶即可。结果判定可通过肉眼直接观察副产物焦磷酸镁沉淀,阳性 反应的反应管内液体浑浊,离心后有白色沉淀集于管底,阴性反应则无此现象。也可 在产物中加 SYBR Green I 等核酸染色剂 ,呈绿色的为阳性反应 ,橙红色

7、为阴性反应。 此外,还可通过琼脂糖电泳 ,用 EB 或 SYBR Green I 染色进行判定。 LAMP 技术具有比普通 PCR更优越的特点 :(1 特异性高 :4 条精确设计的引物严 格地识别靶核酸序列上的6 个独立区域 ,所以 LAMP 不会受到反应混合物中存在的 非靶序列 DNA 影响;(2灵敏度高 :扩增模板量可低至10拷贝或更少 ,而产物扩增指数 达 109-1010个拷贝 ,比普通 PCR法普遍高 1-2个数量级 ;(3 扩增时间短 :LAMP 是恒 温扩增反应 ,在 30min60min内即可完成反应过程。此外,在 LAMP 反应体系中增加 2条环引物可使其反应所需时间比原来缩

8、短近一半,大大提高了检测效率 ; (4设备简单 :LAMP 反应只需一个简单的水浴锅,不需要昂贵的 PCR仪和凝胶成 像系统 ,易于在基层实验室推广应用;(5 结果判定便捷 :可以用肉眼观察反应管内沉淀 的混浊度或者通过SYBR Green I 颜色变化判断结果 ;(6步骤简单 :扩增 RNA 只要在 DNA 基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶,就能够完全像 DNA 基因扩增那样 ,实现 一步扩增 ;(7费用低 :只要一个水浴锅就能完成扩增反应,总费用低 ;(8在检测细菌时 , 无需分离培养细菌 ,可直接提取感染动物组织基因组进行扩增2,3。 2LAMP 技术在动物病原菌检测中的应用目前常用的细

9、菌检测方法包括传统的 细菌培养和生化鉴定法、免疫荧光、EILISA 、PCR等,这些方法都存在一些缺陷,如 细菌培养鉴定法步骤繁杂耗时长,免疫学方法特异性不强 ,PCR法容易出现假阳性 等。目前 ,应用 LAMP 法快速检测病原菌已显示其特有的优势。 Saleh等2 根据鲁氏耶尔森菌 (Yersinia rucker? i 的 yruI/yruR 基因设计一套引物 , 建立了检测鲁氏耶尔森菌LAMP 方法,研究表明 LAMP 比 PCR灵敏 10倍,而且 LAMP 不仅可以检测经培养纯化的细菌,还可以直接从感染鱼的组织基因组中检测 到鲁氏耶尔森菌。 Yamazaki等4建立了检测产毒霍乱弧菌(

10、toxin-producing Vibrio cholerae的高灵敏性的 LAMP 方法,其对 110株菌进行了检测 ,仅 34 株产毒霍乱弧菌 得到了扩增。此方法用于人类粪便中的产毒霍乱弧菌的检测下限是7.8 102cfu/g,比 普通 PCR灵敏 10 倍,且扩增单菌落所用时间不超过35min。 Kayoko 等5对疑被沙门氏菌感染的鸡蛋进行抽样(110 个样品检测 ,并与细菌分 离培养方法和 PCR法做比较。结果显示 ,PCR漏检了 10%,LAMP 及分离培养的检 出率为 100%;表明 LAMP 具有与细菌分离培养相同的灵敏度,而且更加快速。 徐芊等 6针对副溶血弧菌 (Vibri

11、o para? haemolyticu 不耐热溶血毒素基因 (tlh 设 计 4 条特异性引物进行LAMP 扩增,对扩增反应进行优化 ,最佳反应时间为 60min,反 应温度为 60。对 12种细菌共 28株菌进行扩增 ,仅 14 株副溶血弧菌得到阳性扩增 结果,证明引物具有很高的特异性。副溶血弧菌基因组DNA 和纯培养物的检测灵敏 度分别约为 90fg 和 24cfu/ml。结果表明 ,该方法检测副溶血弧菌特异性强、灵敏度 高,并且简便、快速 ,有望成为检测副溶血弧菌的有效手段。Savan等7根据迟钝爱 德华氏菌 (Edwardsiella tarda的溶血素 (haemolysin基因序列

12、设计 4条引物 ,对日本鳗 鲡(Anguilla japonica 等 4 种水生动物和养殖水体中分离的5 株迟钝爱德华氏菌进行 了成功的检测 ,而非迟钝爱德华氏菌病原菌都没有扩增,证明 LAMP 法检测迟钝爱德 华氏菌具有很强的特异性。将LAMP 法和 PCR方法的灵敏性进行比较 ,发现 LAMP 法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10cfu/mL,比 PCR法灵敏 100倍。用 LAMP 法检测正常的和受迟钝爱德华氏菌感染的褐牙鲆,仅从受感染鱼的脾和肾中提取的 DNA 模板能产生特异性扩增 ,并且也检测了养殖水体中的迟钝爱德华氏菌,其最低的 检测浓度为 3.8 10cfu/mL。Yeh等也

13、用 LAMP 法检测了斑点叉尾鲴的爱德华氏菌 (Edwardsiella ictaluri8 和柱状黄杆菌 (Flavobacteri? ira columnare9,比 real-time PCR 法更加灵敏。并且从感染的斑点叉尾鲴的组织中提取的DNA 作为模板 ,均产生了特 异性扩增 ,而正常鱼都没有产生 109 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2009 年增刊 扩增反应 ,证明此法具有简单灵敏的特点。Iwamoto 等10根据结核分枝杆菌复 合群(My? cobacterium tuberculos complex 、鸟结核分枝杆菌 (Mycobacterium

14、 avium subsp.Paratuberculosis 和胞内分枝杆菌的 gyrB 基因序列设计的引物和分枝杆菌属 16S rRNA 保守序列的公共引物 ,用 LAMP 技术对唾液样本中的结核分枝杆菌、鸟分 支杆菌、胞内分支杆菌作了检测,通过检测 24株分枝杆菌和 7株非分枝杆菌证实了 LAMP 的特异性和敏感性。 LAMP 从固体培养基中鉴定出特异的分枝杆菌属只需 35min,液体培养基则需60min。 此外,还有 LAMP 技术检测嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila、胸膜肺炎放 线杆菌 (Acti? nobacillus pleuropneumoniae和葡萄球菌

15、 (Staphylo? coccus等细菌的报 道。 3LAMP 技术在病毒检测中的应用 动物病毒的检测和诊断比较复杂,常用的方法有细胞培养、组织病理学、 Western blot、ELISA 和 PCR方法等 ,但这些方法都有一定的局限性。LAMP 技术因 其简便、快速、经济的特点,在动物病毒的检测上具有很好的应用前景。LAMP 用 于 DNA 病毒诊断的报道相对较多。Gunimaladevi等11根据锦鲤疱疹病毒 (Koi herpesvirus,KHV 胸苷激酶 (thymidine kinase,TK 的基因序列设计引物 ,采用 LAMP 法 检测疱疹病毒 ,检测的灵敏度和PCR方法相

16、似 ,但 LAMP 方法所需的时间仅为 6090min,而 PCR需 34h。LAMP 技术被应用于检测日本对虾白斑综合症病毒 (White spot syndrome virus,WSSV12,对病毒 DNA 的检测限为 10pg级,比巢式 PCR 法灵敏一个数量级。 Caipang等13使用染病真鲷的脾DNA 抽提物 ,用 LAMP 扩增 真鲷虹彩病毒 (Red sea bream iridovirus,RSIV的 DNA,LAMP 比传统的 PCR灵敏度 高 l0 倍,而且利用病毒颗粒拷贝数和反应管混浊度的相互关系,可以对病毒进行量 化。Sun等14采用 LAMP 法检测了南美蓝对虾 (

17、Penaeus stylirostris传染性皮下及造 血组织坏死病毒 (Infec? tious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,I ? HHNV, 反应条件优化为 64反应 60min。Chen等15针对猪细小病毒 (Porcine parvovirus 的非结构蛋白 -1 基因设计一组特异性引物 ,结果显示 LAMP 的敏感性和特异性与 PCR相当,并且 LAMP 的检测下限是 5 个拷贝的猪细小病毒。 RT-PCR可以用于诊断 RNA 病毒,但是费用高 ,而且要经过反转录阶段 ,费时且 效率较低。随着 LAMP 的发展 ,RT-L

18、AMP 已得到应用。 RT-LAMP 第一次应用于日 本山药花叶病毒的检测。秦智锋等16设计了 6 条针对口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus,FMDV3D基因的 8个位点的特异性引物 ,建立了一套从核酸抽提到检测 仅需要 75min 的快速检测 FMDV 的 LAMP 技术,灵敏度与实时荧光RT-PCR 相当, 特异性也强。吴绍强等 17建立了检测亚洲 I 型 FMDV 细胞培养病毒的 RT-LAMP 方法,作者认为 LAMP 法是适合基层和现场检测的快速灵敏实用的方法。Li 等18 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive an

19、d respiratory syn ? drome virus,PRRSV 的开放阅读框 6(ORF6设计了一套引物用于LAMP 扩增,并用猪圆环病 毒-2 (Porcine circovirus type2,PCV-2、猪免疫缺陷病毒 (Simian immunodeficiency virus,SIV、温和型猪瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV、猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV进行对照 ,结果显示此引物特异性高 ,灵敏性也 很高。 Poon LL 等19用 LAMP 和 PCR方法分别对稀释

20、成不同浓度的禽流感病毒 (Avian influenza virus 样本进行检测 ,PCR最低检测到 10-2Pfu,而 LAMP 能在不到 1h 内检测到 10-3Pfu,且可以通过肉眼观察反应所生成的白色沉淀物来快速检测禽流感 病毒,因此 LA MP 在应对农场大规模禽流感病毒检测时有相当广泛的应用前景。李 启明等 20对 51 份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1 亚型禽流感病毒的HA、 NA 基因区进行了 RT-LAMP 检测,并对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明 RT- LAMP 技术的特异性与Real-time PCR结果一致。此方法的灵敏度可达到10个拷贝 模板 RNA。

21、作者认为 RT-LAMP 技术应用于 H5N1 亚型禽流感病毒的快速检测是 一种可行的方法。 Mekata等21采用 RT-LAMP 法检测了斑节对虾的黄头病毒 (Yel? low head virus,YHV, 反应条件优化为 65反应 60 min。Gunimaladevi 等22以 流行性造血器官坏死症病毒病毒(Infectioushaematopoietic necrosis virus,IH ? 110 2009年增刊郑洋妹等 :环介导等温扩增技术检测动物病原研究进展 NV 的 G蛋白为靶序列进行RT-LAMP, 比较了 RT-LAMP 、LAMP 和巢式 PCR 三种方法 ,其中

22、RT-LAMP 以 RNA 为模板 ,cDNA 合成和目标基因的扩增可在单管中 进行,可以节约 3040min反应时间 ; LAMP 灵敏度比巢式 PCR高 10倍。RT-LAMP 和实时 PCR都可作为诊断 IHNV 的很好的方法 ,但是 RT-LAMP 的花费要低很多。 RT-LAMP 还用于检测诺达病毒 (MrNV 、小颗粒病毒 (XSV、病毒性出血性败血症病 毒(VHSV、伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus 、新城疫病毒 (Newcastle disease virus 等。 4LAMP 技术在寄生虫检测中的应用 形态学鉴定一直是寄生虫分类的传统方法,但常常需要对虫体进

23、行染色、固 定、制片等 ,而且要求有一定的经验 ,这种方法越来越显示出它的局限性,尤其对那些 相似种或近缘种来说 ,从形态上很难进行区分 ,需要采用其它方法来对寄生虫进行分 类、鉴定 ,而分子生物学是其中发展最快的一种。随着LAMP 技术的不断改善和成 熟,相信 LAMP 法将成为寄生虫的一种快速检测方法。 Njiru 等23以布氏罗得西亚锥虫 (Trypanosoma brucei rhodesiense 的血清耐药相 关(SRA 基因为靶序列 ,进行了 SPA-LAPM, 该研究显示 LAMP 在检出率和灵敏性方 面均比 PCR高。杨秋林等 24设计 4条扩增日本血吸虫尾蚴钙结合蛋白基因的

24、引物, 进行 LAMP 反应,可检测到最低 1条尾蚴。 EI-Mat? boulim 和 Solimanh25用 LAMP 方法快速检测引起虹鳟增生性肾脏病的孢子虫Tetracapsuloides bryosalmonae, 而且 将 LAMP 方法和常规的 PCR方法进行比较。根据目的基因SSU rDNA 设计 4 条引 物,并且加入了环引物来加速LAMP 反应,整个反应在 1h 内完成 ,LAMP 反应比 PCR 反应的灵敏度高 100倍。同时 ,用 LAMP 法快速检测了寄生鱼和寡毛类动物体上的 黏液孢子虫 (Myxobolus cere? bralis26,检测的灵敏度和 PCR相似,

25、但是,此法需要的 时间更短而且只需要一个水浴锅,更加适用于实际诊断。 Lin 等27根据致病钩端螺 旋体(pathogenic Leptospira的 LipL41 基因设计了一套引物进行LAMP 检测,其检测 的最低极限是 100 个拷贝 ,与普通 PCR和 real-time PCR一致。巴贝西虫病 (Babesia Gibsoni infection 是一种由蜱传播的致命性疾病,会导致犬类的死亡。 Ikadai 等28根 据 18S rDNA 序列设计引物 ,采用 LAMP 和 PCR的方法进行扩增反应 ,两者的检测虫 体密度 (parasitemia的极限均为 0.0005%,但 LA

26、MP 操作简单 ,结果可通过肉眼观察 ,并 且时间比 PCR少 3h。 5LAMP 法在其他领域中的应用LAMP 技术除了用于检测动物病原外,还被广泛 应用于人类病原、食品微生物方面的检测。Yoshikawa29和 Ihira30 等分别建立了 人疱疹病毒 (Human herpes virus6型和 7型的 LAMP 检测方法 ,他们设计的 LAMP 引 物具有高度的特异性和敏感性。Maeda等利用 LAMP 方法建立了一种简单、快速 的检测牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingi? valis 体系,运用了 3种结果判定方法 , 发现琼脂糖电泳和SYBR Green I 的

27、检测极限相近 ,直接沉淀观测法则低10倍;此外, 通过 real-time PCR和 re? al-time LAMP 的比较发现 ,后者更加快速、便捷 ,灵敏度更 高。Seki等31针对肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae 的特异性基因序列lytA 设计 6 条引物 ,利用 LAMP 法来检测肺炎链球菌 ,通过对 10株肺炎链球菌和 6 株非 肺炎链球菌的检测验证了LAMP 法的特异性 ,LAMP 的检测下限为 10拷贝的纯化 DNA,比 PCR法敏感 1000倍,时间只需 60 min。LAMP 技术还用于 SARS 冠状病 毒、巨细胞病毒、登革热病毒、丙型肝炎病

28、毒等方面的研究。 沙门氏菌是引起食物中毒和伤寒的主要病原菌。朱胜梅等32根据沙门氏菌特 异性的 invA 基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP, 同时优化了反应条 件,建立了沙门氏菌的LAMP 快速检测技术。在此条件下,LAMP 检测沙门氏菌 DNA 的敏感度达 10fg,且与其他常见的细菌无交叉反应。Song等33用 LAMP 方法 以志贺氏杆菌 (Shigella enteroinvasive和肠侵染性大肠杆菌 (E.coli 的侵袭性质粒抗原 基因(ipaH 基因作为靶基因进行扩增,白色焦磷酸镁沉淀作为鉴定的依据。试验发现, LAMP 方法的检测灵敏度是8cfu,整个过程只需

29、 2h,而 PCR反应是 8 10cfu。 6应用前景 LAMP 技术在快速检测和鉴定动物病原方面不仅具有重要的理论意义,而且具 有很高的实用价 111 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2009 年增刊 值。该方法快速高效 ,整个过程在恒温条件下进行,避免了常规 PCR对于温度循 环的特殊要求所带来的种种不便。实验结果判定可以直接使用副产物 焦磷酸镁的浊度检测法。由于该方法简单易行,提高了 LAMP 的使用价值。 目前,LAMP 在以实用研究为主导的日本非常热门。 LAMP 技术作为一种检测技术 ,在核酸研究方面具有重要的作用,尤其在人类和 动植物的病原检测方面具有良

30、好的发展前景。LAMP 方法是分子生物学领域的一种 新的技术 ,同样存在一些不足。由于LAMP 法阳性反应呈现梯度条带,并不像 PCR 只呈现单带 ,一旦产生非特异性扩增 ,则不易鉴别。因此 ,应特别关注反应的特异性,可 通过对目标序列特异的限制性酶切割扩增产物进行验证。另外,从分子生物学研究 的角度看 ,还应该对 LAMP 反应的理论基础作更系统、更深入的探讨,扩大其在分子 生物学领域的应用范围 ,以便开发出方便、快捷、实用的LAMP 检测试剂盒。 参考文献 1Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Nucleic Acids Research,2000,2

31、8:e63. 2Saleh M,Soliman H,El-Matbouli M.BMC Veterinary Research, 2008,4:31. 3Itano T,Kawakami H,Kono T,et a1.J Appl Microbiol,2006,100 (6:13811387. 4Yamazaki W,Seto K,Taguchi M,et a1.Microbiology,2008,8:94. 5Kayoko Ohtsuka,et a1.Applied and environmental microbiology. 2005,11(71:67306735. 6徐芊,孙晓红 ,赵

32、勇,等.中国生物工程杂志 ,2007,27(12: 6672. 7Savan R,Igarashi A,Matsuoka S,et a1.Appl Environ Microbiol, 2004,70(1:621624. 8Yeh HY,Shoemaker CA,Klesius PH.J Microbiol Methods, 2005,63(1:363364. 9Yeh HY,Shoemaker CA,Klesius PH.J Appl Microbiol,2006,100 (5:919925. 10Iwamoto T,Sonobe T,Hayashi K.Journal of Clinica

33、l Microbiolo- gy,2003,41:26162622. 11Gunimaladevi I,Kono T,Venugopal M N,et a1.J Fish Dis, 2004,27(10:583589. 12Kono T,Savan R,Sakai M,Itami T.Journal of Virological Meth- ods,2004,115:5965. 13Caipang CM,Haraguchi I,Ohira T,et al.Journal of Virological Methods.2004,121:155161. 14Sun ZF,Hu CQ,Ren CH,

34、et a1.J Virol Methods.2006,131(1: 4146. 15Chen CM,Cui SJ.J Virol Methods,2009,155(2:1225. 16秦智锋 ,曾少灵 ,阮周曦 ,等.中国预防兽医学报 .2008,30(5: 375378. 17吴绍强 ,孙晓智 ,林祥梅 ,等.检验检疫科学 ,2008,18(1:912. 18Li Q,Zhou QF,Xue CY.J Virol Methods,2009,155(1:5560. 19Poon LL,Wong BW,Chan KH,et al.J Clin Microbiol,2005,43 (7:34573

35、4591. 20李启明 ,马学军 ,高寒春 ,等.病毒学报 ,2008,24(3:179185. 21Mekata T,Kono T,Savan R,et a1.J Virol Methods,2006,135 (2:151156. 22Gunimaladevi I,Kono T,Lapatra SE,et al.Archives of Virology, 2005,150:899909. 23Njiru ZK,Mikosza AS,Armstrong T,et al.PLoS Negl Trop Dis, 2008,2(1:e147. 24杨秋林 ,许丽芳 ,张愉快 ,等.中国血吸虫病防治杂

36、志 ,2008,20 (3:209211. 25EI-Matboulim,Solimanh.Parasitol Res,2005,96(4:277284. 26EI-Matboulim,Solimanh.J Fish Dis,2005,28(9:549557. 27Lin X,Chen Y,Lu Y,et al.Diagn Microbiol Infect Dis,2009,63 (3:237242. 28Ikadai H,Tanaka H,Shibahara N,et a1.J Clin Microbiol,2004,42 (6:24652469. 29Yoshikawa T,lhira M

37、,Akimoto S,et a1.Journal of Clinical Micro biology,2004,42(3:13481352. 30Ihira M,Yoshikawa T,Enomoto Y,et a1.Journal of Clinical Micro- biology,2004,42(1:140145. 31Seki M,Yamashita Y,Toriaoe H,et a1.J Clin Microbiol,2005,43 (4:1581l586. 32朱胜梅 ,吴佳佳 ,徐驰,等.现代食品科技 ,2008,24(7:725730. 33Song T,Toma C,Nakasone N,et al.FEMS Microbiology Letters, 2005,243.259263. 112