《国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书-基因操作和蛋白质工程技术专题.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书-基因操作和蛋白质工程技术专题.doc（32页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、 课题类型：1.探索导向类 申请受理编号： 2.目标导向类 国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书 技术领域名称：生物和医药技术领域 专题名称：基因操作和蛋白质工程技术专题申请指南技术方向：小RNA（small RNA）关键技术课题名称：抗乙型肝炎病毒siRNA肝特异性给药载体 中华人民共和国科学技术部二六 年 九 月 十五 日填 写 说 明一、请严格按照表中要求填写各项。二、专题课题申请人可以是自然人或法人。若自然人申请课题，需有课题依托单位，申请人为该自然人；若法人申请课题，法人是当然的依托单位，封面中的申请人应填写法人名称，申请负责人由法人指定。每个课题申请只能有一个申请人和
2、一个课题依托单位。三、申请书中第一次出现外文名词时，要写清全称和缩写，再出现同一词时可以使用缩写。四、组织机构代码是指课题承担单位组织机构代码证上的标识代码，它是由全国组织机构代码管理中心所赋予的唯一法人标识代码。五、附件中相关材料需要以电子文档方式上传，具体要求详见国家科技计划项目申报中心网站中的863计划申报用户手册。 六、审核意见和声明中需填写课题依托单位/协作单位负责人姓名和申请人姓名，单位管理员提交国家科技计划项目申报中心后，即视为审核意见和声明有效，申请人和课题单位负责人需对申请书内容的真实性和有效性负责。一、基本信息课题名称抗乙型肝炎病毒siRNA肝特异性给药载体行业领域人口与健
3、康预计完成年限3.0年课题密级公开级预期成果类型论文、实物、专利申请（负责）人信息依托单位信息协作单位信息单位名称单位性质组织机构代码课题经费来源（万元）总经费100申请863计划资助100其它国家级资助(包括部门匹配)地方政府匹配银行贷款自有资金其它资金经费备注所在单位 课题参加总人数 8 。 其中：高级职称 3 人， 中级职称 1 人， 初级职称 4 人， 无职称 0 人； 其中具有：博士学位 3 人， 硕士学位 0 人， 学士学位 5 人， 其它 0 人； 合计：投入 168 人月。二、课题组主要研究人员情况在课题中分担的任务课题组中职务(组长、副组长或成员）为本课题工作时间（人月）专
4、业职务职称出生日期性别姓 名序号123456789102.1课题组长、副组长资历情况课题组长-童贻刚-资历情况：学历：1997.8-2000.7 军事医学科学院医学微生物学专业，获理学博士学位。1988.8-1991.7 军事医学科学院医学遗传学专业，获医学硕士学位。1984.9-1988.7 复旦大学生物工程系遗传和遗传工程专业，获理学学士学位。工作经历：2001.9-至今 军事医学科学院微生物流行病研究所，副研究员2003.4-2005.4 加拿大不列颠哥伦比亚大学（UBC）,博士后主要从事传染病的分子生物学和抗体工程的研究工作，两次获得军队科技进步二等奖（分别为第二2001-2-101-
5、2、第三贡献人96-2-7-3），在加拿大留学期间获得Micheal Smith奖(http:/msfhr.org/)。完成863课题一项No.1502201，“抗人整合素v3人源化抗体的研制”，2002-2004；北京市自然科学基金课题一项No.5022012，“人源抗-Tie2完整抗体在CHO细胞中的表达”，2002-2004；总后“八五”计划青年基金一项，“丙型肝炎病毒中国株基因组核苷酸序列分析及其与国外株的比较”， 1991-1993。国外发表论文9篇，国内发表论文40余篇。近几年来，本人在加拿大做过一些siRNA方面的研究工作，具体做法是用siRNA技术敲除gamma-secrata
6、se的亚基APH-1、PEN-2和Nicastrin。2005年回国以后即开展肝细胞特异性基因治疗载体的研究工作，已经完成一些基础性的构建工作，如已经构建成功用于缺陷HBV的包装质粒，并以此构建了假病毒包装细胞系；已经构建病毒基因全部剔除的缺陷HBV载体，并且已经将绿色荧光蛋白基因插入其中，目前正在进行假病毒的分泌试验，相关工作正在申请专利。代表作品：1. Sun X, Tong Y, Qing, H. Chen C-H, and Song W (In Press). Increased BACE1 Maturation contributes to Alzheimers Disease pa
7、thogenesis in Down Syndrome. The FASEB Journal 20(9):1361-8. 2. Li Y, Zhou W, Tong Y, He G, and Song W (2006). Control of APP Processing and A Generation Level by BACE1 Enzymatic Activity and Transcription. The FASEB Journal 20(2):285-92. 3. Tong Y, Zhou W, Fung V, Christensen MA, Qing H, Sun X, and
8、 Song W (2005). Oxidative stress potentiates BACE1 gene expression and Ab Generation. Journal of Neural Transmission 112(3):455-69.4. Sun X, Wang Y, Qing H, Christensen MA, Liu Y, Zhou W, Tong Y, Xiao C, Huang Y, Zhang S, Liu X, and Song W. (2005) Distinct Transcriptional Regulation and Function of
9、The Human BACE2 and BACE1 Genes. The FASEB Journal 19(7):739-749.5. Qing H, Zhou W, Christensen MA, Sun X, Tong Y, and Song W. (2004) Degradation of BACE by the Ubiquitin-Proteasome Pathway. The FASEB Journal 18(13):1571-3.6. Zhou W, Qing H, Tong Y, and Song W. (2004) BACE1 Gene Expression and Prote
10、in Degradation. Annals of the New York Academy of Sciences 1035:49-677. Hou, L., Du, G., Guan, R., Tong Y. and Wang, H. (2003). In vitro assay for HCV serine proteinase expressed in insect cells. World J Gastroenterol 9(7):1629-32. (PMID: 12854181)8. Du, G., Hou, L., Tong Y. and Wang, H. (2002). Est
11、ablishment of a simple assay in vitro for hepatitis C virus NS3 serine protease based on recombinant substrate and single-chain protease. World J Gastroenterol. 8(6):1088-93. (PMID: 12439931) 9. Hou, L., Du, G., Tong Y. and Wang, H. (2002). Identification of B cell epitopes of hepatitis C virus RNA
12、dependent RNA polymerase. J Virol Methods 104(1):1-8. (PMID: 12020787)10. Mi Zhibao, Feng Fumin, Zhang Xitan, Lian Zhenhua, Wang Hongli Tong Yigang. The signficance of HBV preS1 peptide and anti-preS1 antibody in HBV infection. Chinese Medical Journal. 1999;112(4)321-2411. Mi Zhibao, Guo Jutao, Feng
13、 Fumin, Chen Wen, Zhang Xitan, Tong Yigang. Expression of HBV preS1 peptide in E.coli and product characterization. Chinese Medical Sciences Journal 1997;12:37-4112. 李建民,陈薇,贾秀杰,安小平,李冰,樊英茹,童贻刚. 用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究. 细胞与分子免疫学杂志, 2005,03:52-55+58.13. 廖振林,侯利华,李建民,陈薇,王臣,王慧春,安小平,童贻刚. 半合成抗体库的构建及抗Tie2
14、 Fab抗体的筛选. 微生物学通报, 2004,06:40-44. 14. 吕永强,杜桂鑫,童贻刚. 应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段. 第三军医大学学报, 2004,20:88-90. 15. 李建民,陈薇,安小平,李冰,樊英茹,郝晓萌,左少军,童贻刚. 基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004,10:31-35. 16. 吕永强,杜桂鑫,廖振林,罗保君,童贻刚. 人血管生成素-1基因的克隆及表达载体的构建. 武警医学院学报, 2004,05:37-39. 17. 廖振林,侯利华,陈薇,童贻刚. Tie2受体研究进展及其在抗肿瘤治
15、疗中的应用. 生物技术通讯, 2004,04:69-71. 18. 李建民,陈薇,安小平,樊英茹,郝晓萌,李冰,陈万荣,刘树玲,童贻刚. 抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达. 军事医学科学院院刊, 2004,03:27-30. 19. 王臣,侯利华,张彦明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陈薇,童贻刚. 抗人整合素_3 单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2004,05:12-16.20. 王臣,侯利华,张彦明,李建民,廖振林,杜桂鑫,陈薇,孙启鸿,童贻刚. 抗人整合素_3单链抗体的构建和表达. 细胞与分子免疫学杂志, 2004,
16、02:36-39.21. 吕永强,廖振林,童贻刚. 人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达. 临床军医杂志, 2003,03:6-8. 22. 童贻刚,王海涛,徐静,付玲,于长明,刘国奇. 人源抗-HBsAg-干扰素融合蛋白在CHO细胞中的表达. 中华肝脏病杂志, 2001,02:114-116.23. 童贻刚，徐静，刘国奇，张永国，陈万荣，刘树玲，王海涛。人免疫球蛋白IgG1亚型Fc基因的克隆以及人抗-HBsAg全分子抗体在哺乳细胞中的表达。生物化学与生物物理学报2000;32(4):392-9624. 童贻刚，王海涛，徐静，付玲，于长明，刘国奇。人源抗-HBsAg-干扰素融合蛋白在CHO
17、细胞中的表达。中华肝脏病杂志 2001;9(2):115-1725. 童贻刚，杜勇，徐静，李敬云，鲁晏希，鲍作义，王海涛。HIV p24蛋白在大肠杆菌中的高效表达、一步纯化及抗原性分析。中国病毒学杂志，2000;15(2):116-2126. 童贻刚，王海涛，陈万荣. 中国人-神经生长因子前体基因的克隆及其序列分析。中国应用生理学杂志1997;13(4):316-1827. 童贻刚，黄耀煊，邬广惠. HBV X基因在大肠杆菌中高效表达及血清抗X抗体的检测。生物工程学报1993;9(3):252-5528. 童贻刚，李谐勋，李育阳，高卜渝. A干扰素基因在酿酒酵母中的表达。复旦学报:自科版.19
18、90;29(4):368-3732.2课题组长、副组长目前承担863计划和其它国家科技计划课题情况（包括人员姓名、承担课题名称、课题经费数、课题起止时间、所属科技计划名称等信息）姓名承担课题名称课题经费数（万元）课题开始时间课题结束时间所属科技计划其他说明事项：课题组长去年从国外留学回国，尚未承担其它国家计划课题。2.3课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题向863计划和国家其它科技计划提出申请（如有，请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情况，并说明与本课题申请的关系）否三、课题情况3.1课题简介目的意义：慢性乙型肝炎是严重影响我国人民身体健康的一种疾
19、病，尽管干扰素和核苷类似物对该病有一定的疗效，但仍然存在很多的问题，如治疗效果不好，停药后反弹，易产生耐药突变，价格昂贵等，因此新的治疗方案亟待开发。RNA干扰是近年来发展起来的一项新的技术，具有非常诱人的应用前景，已经有多个相关的产品进入临床试验。由于乙型肝炎病毒基因组非常紧凑，绝大部分区域存在基因重叠，因此其突变将受到很大的限制，这一特点使它尤其适合于基于核苷酸序列的治疗方案，而这类方案中，小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)最具潜力。主要研究内容:本项目将研制一种新型的肝细胞特异性的siRNA给药系统，该系统由乙型肝炎病毒（hepatitis B v
20、irus, HBV）基因组改造而来，经定点突变破坏HBV的所有的开放阅读框（open reading frame, ORF），使之不表达任何病毒蛋白质，但是可以被患者肝细胞中的野生型病毒提供的蛋白质复制和包装，产生假病毒颗粒，该假病毒颗粒可以分泌到细胞外，进而感染其他的肝细胞。由于该假病毒载体上克隆了短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)基因(在细胞内经过转录和加工即可变成siRNA)，该基因的表达可以抑制野生型病毒蛋白质的表达，发挥抗病毒作用。这样，在患者的肝细胞中，野生型病毒帮助假病毒载体复制，而假病毒载体携带的shRNA反过来抑制野生型病毒的蛋白质表达和基因组复
21、制，二者将形成负反馈平衡，并且长期稳定，直至野生型病毒被机体的免疫系统清除，假病毒也将随之消失。该siRNA给药系统将具有以下几个特点：1、除了患者已经有的病毒蛋白成分之外，不携带任何其他的抗原成份，不会激发机体的免疫，安全性更好；2、可以被野生型病毒复制，因此具有放大作用，使用很小的剂量即可充分发挥其效果；3、假病毒载体以负反馈方式稳定地平衡并抑制野生型病毒的表达与复制，可以产生良好的抗病毒效果，并且可以长期发挥作用（无需多次用药），直至野生型病毒被机体免疫系统清除。预期目标：1、 建立安全、不会产生野生型病毒的假病毒包装细胞系。2、 构建分泌能力强、且能有效表达外源基因的假病毒载体。3、
22、设计合成并筛选到具有抗-HBV作用的shRNA。4、 获得表达绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP）和抗-HBV shRNA的假病毒颗粒。5、 假病毒具有良好的感染原代培养人肝细胞的能力。6、 假病毒在鼠移植人肝细胞模型中具有良好的超感染能力。3.2课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势，课题主要研究技术国内外专利授权情况国内外发展现状与趋势:RNA干扰是近年来发展起来的一项新的技术，具有非常诱人的应用前景，已经有多个相关的产品进入临床试验（用于预防与治疗丙肝病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒感染和老年视网膜黄斑变性、哮喘，Hunting
23、tons disease等）。近年来大量的实验证明针对HBV的siRNA具有良好的抗HBV蛋白质表达和复制的作用1。siRNA的应用有两种方式，一种是直接使用体外人工合成的siRNA，这种方式成本很高，而且被肝细胞特异地摄入的机会很小；另一种方式是使用适当的载体将编码siRNA的基因运送到被病毒感染的肝细胞中，使其在肝细胞内表达成shRNA，该shRNA随即被细胞内的Dicer酶降解为siRNA。第二种方式近年来受到越来越多的重视，适合于在基因治疗中使用。常用的基因治疗载体均可用于siRNA的递送，但是常规的基因治疗载体有许多缺点，如病毒载体自身的抗原造成机体免疫应答；病毒载体基因组重组到宿主
24、细胞中引发基因突变和癌变；病毒载体缺乏组织特异性而造成毒副作用的增加；需要多次反复的注射。研制新型siRNA给药载体，避免上述常规给药载体的各种缺点是本研究的出发点。HBV是一种嗜肝DNA病毒，基因组全长只有3.2kb，可以作为基因治疗载体。该载体分子量小，易于进行克隆操作，而且具有肝细胞特异性，非常适合于肝细胞的基因治疗，如肝癌、慢性病毒性肝炎、与肝细胞功能相关的代谢遗传病等。如果将该载体应用于慢性乙型肝炎的治疗，则具有非常特异的放大效果，因为患者肝细胞中存在的HBV蛋白成分可以复制治疗性的病毒载体（假病毒）并分泌到细胞外，该假病毒又可以感染其他的肝细胞，并在肝细胞内与野生型病毒达到负反馈平
25、衡，直至病人体内的野生型病毒被机体清除，假病毒也无法复制，因此会一同消失。国外很早就有人研究使用缺陷型HBV作为基因治疗载体2,3，已经有多篇文献证明，携带外源基因的缺陷型HBV基因组可以被辅助细胞系包装成假病毒颗粒，假病毒颗粒可以感染人肝细胞，并能在肝细胞内有效地表达外源基因4-7。Untergasser等人将HBV的开放阅读框全部敲除，引入外源基因，产生假病毒的效率并未有明显的下降6。用这种假病毒作为基因治疗载体将g-干扰素特异性地导入黑猩猩肝细胞，可以激发机体对丙型肝炎病毒感染的特异性和非特异性免疫7。国内北京军区总医院胡大荣教授也曾经构建过类似的辅助细胞系和假病毒表达载体，但未见后续研
26、究论文发表。目前国内外尚未见用这种载体进行HBV感染治疗的报道，而这正是该载体系统最大限度地发挥作用并且具有最小毒副作用的应用领域，也是中国社会急需解决的大难题。本研究将从这个角度研究开发这一给药载体系统。相关研究尚未见专利保护。1.Arbuthnot, P., Carmona, S. & Ely, A. Exploiting the RNA interference pathway to counter hepatitis B virus replication. Liver Int 25, 9-15 (2005).2.Horwich, A. L., Furtak, K., Pugh, J.
27、 & Summers, J. Synthesis of hepadnavirus particles that contain replication-defective duck hepatitis B virus genomes in cultured HuH7 cells. J Virol 64, 642-50 (1990).3.Ganem, D. An advance in liver-specific gene delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11696-7 (1999).4.Chiang, P. W., Jeng, K. S., Hu,
28、 C. P. & Chang, C. M. Characterization of a cis element required for packaging and replication of the human hepatitis B virus. Virology 186, 701-11 (1992).5.Yoo, J., Rho, J., Lee, D., Shin, S. & Jung, G. Hepatitis B virus vector carries a foreign gene into liver cells in vitro. Virus Genes 24, 215-2
29、4 (2002).6.Untergasser, A. & Protzer, U. Hepatitis B virus-based vectors allow the elimination of viral gene expression and the insertion of foreign promoters. Hum Gene Ther 15, 203-10 (2004).7.Shin, E. C. et al. Liver-directed gamma interferon gene delivery in chronic hepatitis C. J Virol 79, 13412
30、-20 (2005).3.3课题主要研究内容、拟解决的技术难点和主要创新点，现有研究基础课题主要研究内容：1. 建立安全的假病毒包装系统：目前我们已经构建了一种包装细胞系，可用于一些预试验，但是安全性不够。因此我们准备重新构建更加安全的包装细胞系，将HBV的S、C、P、X基因进行重排，并克隆到不同的真核表达载体上，转染肝癌细胞系HepG2，构建稳定细胞系。该细胞系将不能与假病毒的包装信号重组，从而不会导致野生型病毒的产生。2. 构建能有效分泌假病毒基因组的质粒：我们已经构建了一种假病毒基因组，其分泌效果正在研究。为了能够得到高效分泌且外源基因能有效表达的假病毒基因组，还需要尝试多种构建方法，包
31、括保留P基因ORF、进行分子进化（DNA shuffling）等。同时使用绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescence protein, EGFP）作为报告基因，转染2.2.15细胞，验证报告基因的表达。3. 筛选具有抗-HBV作用的shRNA：设计合成shRNA基因，插入上述假病毒载体以替代EGFP报告基因，转染2.2.15细胞，验证和筛选抗-HBV活性高的shRNA。4. 分别将含有EGFP和shRNA的假病毒基因组转染的辅助细胞系，研究假病毒产生的效率以及所携带的外源基因的表达情况，获取表达EGFP和shRNA假病毒粒子。5. 分别用EGFP和shRNA假病毒
32、粒子感染原代培养慢性乙肝病人活检肝细胞，研究假病毒的感染效率、所携带的外源基因的表达状况以及shRNA的抗-HBV效果。6. 建立人鼠嵌合肝组织动物模型：将慢性乙肝病人肝组织移植到NOD/SCID免疫三缺陷小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司有售）体内，人肝组织将在该小鼠体内定居生长。将假病毒颗粒自尾静脉注入小鼠体内，研究假病毒在该动物模型中的超感染能力、外源基因的表达状况以及外源shRNA的抗病毒效果。技术难点:1、人鼠嵌合肝动物模型：尽管近年来不少文献报道了该模型，但是其技术难度还是不容忽视。首先是NOD/SCID免疫三缺陷小鼠生长条件要求很高；其次、操作要求十分小心，以免感染；第三，做小动物
33、的肝移植手术技术难度较大，需要很有经验的人员操作。本单位实验动物中心是国内最早从事实验动物研究的专业单位之一，具有雄厚的技术实力和软硬件条件，能够协助本课题建立上述模型。2、假病毒载体的构建：假病毒载体含有与野生型病毒一样大小的基因组，连同克隆载体大小接近10kb，含有复杂的酶切位点，要对其中的基因进行定点敲除，或者在特定的位置插入外源基因，具有较大的难度。本课题研究人员在基因克隆操作上有丰富的经验，并能熟练地应用生物信息学分析软件进行分析、设计工作，最近我们还发明了一种替代重叠PCR(polymerase chain reaction)进行定点突变的方法（已投稿），这些基础对于我们完成上述工
34、作提供了保障。3、包装细胞系的安全性：目前我们构建的包装细胞系是将野生型病毒的基因组中的包装信号去除，因此该基因组不能被包装，但是可以表达病毒包装所需要的全部蛋白质。如此构建的包装细胞系在转染假病毒载体时，假病毒载体上的包装信号有可能与包装细胞系中的病毒基因组发生重组，尽管这种重组的几率很低，但仍然是一种不安全因素。解决这个问题的办法是将病毒蛋白基因重新组合，分别克隆在不同的载体上，这样假病毒载体上的包装信号即使与包装细胞系发生重组，也无法产生野生型病毒基因组。4、假病毒的产生效率：假病毒的产生效率是影响假病毒载体在慢性乙肝病人体内的放大效应和抗病毒效果的一个很重要的因素，对于假病毒的产生效率
35、，文献报道不太一致。有人认为HBV前基因组RNA作为mRNA指导翻译的聚合酶将与前基因组结合在一起并启动病毒基因组的逆转录和复制，如果聚合酶不是由前基因组RNA翻译而来，而是由包装细胞系以反式作用方式提供，则包装效率会降低；但是也有文献报道，去掉所有ORF的假病毒基因组的包装效率并没有下降（参见国内外发展现状与趋势参考文献）。为了获得分泌能力强并能有效表达外源基因的假病毒载体，很可能需要以不同的方案构建不同的载体，包括保留P基因ORF,尝试不同的突变ORF的方法，以及外源基因不同的插入位点，甚至使用体外分子进化技术（DNA shuffling）来寻找合适的突变。主要创新点:利用突变的病毒去攻击
36、同种野生型病毒（“以毒攻毒”）。这种治疗方法的优点在于，只要野生型病毒还存在，突变病毒就能生存，从而保持持久的治疗作用，因此只需用药一次，即可终身受益。由于野生型病毒的存在，治疗用的突变性病毒将不会带入任何新的外来抗原，不会给机体带来不利的影响。这种治疗具有很强的组织的特异性，理论上几乎不会产生严重的毒副作用。本研究所获得的病毒载体系统还可以作为人肝细胞特异的的基因治疗载体，可以用于慢性病型肝炎、肝炎、肝硬化等疾病的治疗，也可以某些遗传病的基因治疗。此外，这种“以毒攻毒”的思路也适合于其他慢性病毒感染疾病如丙型肝炎、艾滋病等的治疗。现有研究基础:本人在加拿大UBC期间做过一些siRNA方面的研
37、究工作，用siRNA技术敲除gamma-secretase的亚基APH-1、PEN-2和Nicastrin。2005年回国以后即开展肝细胞特异性基因治疗载体的研究工作，已经完成一些基础性的构建，如已经构建成功用于缺陷HBV的包装质粒，并以之建立了包装细胞系；已经构建ORF全部剔除的缺陷HBV载体，并且已经将绿色荧光蛋白基因插入其中，目前正在进行假病毒的分泌试验，已经具备良好的工作基础。本研究的有关专利正在申请之中。1、 siRNA的研究基础本人于加拿大UBC大学学习期间（2003.4-2005.4），从事了较多的关于siRNA的研究工作，主要涉及用siRNA技术敲除细胞中APH-1、PEN-2
38、和Nicastrin三种基因（图1），研究这些基因的敲除对蛋白酶g-secretase功能的影响。图1、siRNA对靶基因表达的影响。先用带有myc标签的质粒APH-1myc、PEN-2myc和NCTmyc转染Hek293细胞，分别用相应的siRNA处理，最后用抗-myc单克隆抗体检测，ECL显色。2、 乙型肝炎病毒的研究基础课题申请人于80年代后期即开始从事传染病方面的研究工作，尤其是乙型肝炎病毒分子生物学方面的工作，曾在贾克明教授主持的中国人民解放军肝病研究所从事研究工作多年，对HBV和临床HBV感染有较好的认识，曾经克隆HBV基因组，表达过HBV抗原等，具有相关的研究材料和其他资源。3、
39、 HBV包装细胞系课题申请人自2005年5月回国后，在本单位回国人员启动基金的资助下开展HBV假病毒载体的研究，现在已经取得了一些研究进展，包括改造HBV基因组克隆，构建不含包装信号但可以表达所有病毒蛋白的辅助质粒（图2），并且用来转染人肝癌细胞系HepG2，筛选到稳定表达HBsAg和HBeAg的细胞克隆。图2、用于构建包装细胞系的辅助质粒。4、 HBV假病毒载体同时我们已经构建成功HBV假病毒载体，该载体包含部分重复的HBV全基因组，含有包装信号，但是Pol、S、C、X基因的ORF均已经被破坏，同时已将EGFP基因表达框插入其中（图3），用该质粒转染上述包装细胞系，可见细胞中有绿色荧光（图4
40、），表明外源基因在该假病毒载体中可以表达。图3、表达EGFP的假病毒载体。图4、假病毒携带的EGFP在包装细胞系中的表达5、 Realtime-PCR定量检测假病毒为了分析假病毒的产生效率，我们用自己配制的Realtime-PCR试剂建立了对假病毒进行定量的分析方法（图5）。图5、Realtime-PCR定量检测假病毒3.4课题预期达到的目标、主要技术指标，可获得专利等知识产权及人才培养情况预期达到的目标、主要技术指标：1、 建立安全的假病毒包装系统。2、 构建能有效分泌假病毒基因组的质粒。3、 获得含有EGFP的假病毒颗粒。4、 筛选到具有抗-HBV作用的shRNA。5、 获得表达抗-HBV
41、的shRNA的假病毒颗粒。6、 假病毒有较好的产生效率。7、 假病毒具有良好的感染原代人肝细胞的能力。8、 假病毒在人鼠嵌合肝模型中具有良好的感染能力。专利：国际专利一项国内专利两项论文：国外发表两篇国内发表五篇人才培养:博士两名硕士五名3.5课题拟采取的研究方法，课题技术路线（或实施方案）及其可行性分析（如有协作单位，请说明课题的任务分工）研究方法:采用分子生物学的研究方法，构建用于siRNA肝特异性给药载体，并使用原代培养人肝细胞模型和人鼠嵌合肝模型研究研究该载体的给药效果。技术路线构建HBV S、C、P、X基因表达质粒转染HepG2建立包装细胞系构建假病毒载体，去掉HBV S、C、P、X
42、基因分别插入EGFP和抗-HBV siRNA基因分泌假病毒感染原代培养活检人肝细胞感染人肝细胞移植NOD/SCID小鼠模型其可行性分析:国外很早就有人研究使用缺陷型HBV作为基因治疗载体，已经有多篇文献证明，携带外源基因的缺陷型HBV基因组可以被辅助细胞系包装成假病毒颗粒，假病毒颗粒可以感染人肝细胞，并能在肝细胞内有效地表达外源基因。Untergasser等人将HBV的开放阅读框全部敲除，引入外源基因，产生的假病毒的效率并未有明显的下降。用这种假病毒作为基因治疗载体将g-干扰素特异性地导入黑猩猩肝细胞，可以激发机体对丙型肝炎病毒感染的特异性和非特异性免疫。国内北京军区总医院胡大荣教授也曾经构建
43、过类似的辅助细胞系和假病毒表达载体，但未见后续研究论文发表。3.6课题预期研究成果对相关技术发展的影响和应用转化前景的预测（包括国内外应用或市场现状、潜在用户、市场前景，经济效益和社会作用等）全球约有20亿人感染过乙型肝炎病毒（HBV），近3.5亿人终身携带HBV，或者罹患慢性乙型肝炎，其中有相当一部分人会发展成肝硬化或者肝癌。全球每年约有一百万人死于HBV引起的疾病。我国是乙型肝炎大国，超过一亿的人口终身携带HBV。HBV感染造成的损失和潜在的威胁，是一个不容忽视的社会问题。目前对于急慢性HBV感染尚无根治措施或十分有效的治疗手段，除干扰素治疗有一定的效果外，近年发现了一些小分子逆转录酶抑制
44、剂也对乙型肝炎有一些治疗效果，但是这些治疗都有一些不足，干扰素比较昂贵，长期大剂量使用可能产生抗干扰素抗体，而且可能会产生耐干扰素的突变株；使用小分子逆转录酶抑制剂则更容易产生耐药突变株8。各种疗法效果都有限，一般不能达到根治的目的，停药后疾病会反弹。因此，开发新的治疗手段具有重要意义。据相关资料分析，目前肝病药物市场约为每年100亿元人民币，其中主要是乙型肝炎药物。然而真正有效的乙肝药物只有干扰素和核苷类似物，后者为外国公司垄断，而且二者都很昂贵，需要长期使用，病人负担很大。本研究开发的药物理论上只需使用一次，即可长期有效，因此费用将会非常低廉，几乎所有人都用得起。该药物可能使国内慢性乙型肝
45、炎病人摆脱对国外药物的依赖，并且不再需要持续的用药。该药不仅可以在国内使用，而且可以打入国际市场（相关专利正在申请中），将发挥巨大的经济效益，而且产生巨大的社会效益。3.7课题组现有及依托单位承诺提供的支撑条件，其它所需增添的支撑条件和主要仪器设备（说明用途）课题组所在的实验室是病原微生物生物安全国家重点实验室，长期从事病原微生物的研究，能够为本课题提供的支撑条件：1、 基因转移仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、定量PCR仪、高速冷冻离心机，用途：基因克隆与表达2、 二氧化碳孵箱、倒置显微镜、倒置荧光显微镜，用途：细胞培养3、 生物安全柜，用途：保证安全地操作乙型肝炎病毒4、 实验动物中心，用途：NOD/SCID小鼠的实验以及人鼠嵌合肝模型的操作。目前已经具备本课题所需要的设备，不需增添新的大型仪器设备。3.8课题经费支出预算（包括总经费和申请863计划经费的支出预算） 单位：万元科 目预算数申请从863计划经费中列支数备 注1、人员费5.05.0研究生2、设备费1.01.0加样器3、材料费68.068.