川贝母性状鉴别分子鉴定方法的分析比较.pdf

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1、中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集 为保证绿原酸、连翘酯苷A 、槲皮苷、黄芩苷4 种成分都可提取完全，作者考察了甲醇、7 0 甲醇、乙醇、7 0 乙醇4 种提取溶剂，0 5 小时、l 小时、1 5 小时3 个提取时间，超声、回流两种 提取方式，最终确定提取方式为7 0 甲醇超声提取1 小时，4 个成分的提取效率最高。 3 2 检测波长的选择 分别取绿原酸、连翘酯苷A 、槲皮苷、黄芩苷对照品储备溶液，在2 0 0 4 0 0n m 波长范围内进 行扫描，绿原酸、连翘酯苷A 约在3 3 0n m 、槲皮苷约在2 6 0n m 、黄芩苷约在2 7 7n m 波长处有最 大吸收，根据样品中各

2、成分出峰时间将波长设定为：3 3 0n m ( 0 1 0m i n ，绿原酸、连翘酯苷A ) 、 2 6 0r i m ( 1 0 - - 一1 5m i n ，槲皮苷) 、2 7 7n m ( 1 5 2 0m i n ，黄芩苷) ，以实现在各成分最大吸收波长处同 时检测的目的。 3 3 流动相的选择 比较了乙腈一0 1 磷酸溶液和乙腈6m m o l L 。1 磷酸二氢钾溶液两个系统，结果乙腈0 1 磷酸 溶液梯度洗脱条件下4 个成分的分离效果更好，出峰时间更适宜。 3 4 阴性溶液的制备 绿原酸为金银花的指标成分之一，据文献【5 】报道鱼腥草中也含有绿原酸，故实验对金银花阴 性及金银花

3、、鱼腥草双阴性均进行了考察，发现金银花阴性样品色谱图中仅有一峰面积很小的绿 原酸峰，表明复方鱼腥草片中的绿原酸主要来源于金银花药材。 4 小结 本文通过不同检测时段波长切换，建立了超高效液相色谱法同时测定复方鱼腥草片中绿原 酸、连翘酯苷A 、槲皮苷和黄芩苷的含量，经方法学验证，所建立的测定方法符合定量分析要 求，且实现同时对方中金银花、连翘、鱼腥草和黄芩的质量控制，为更全面提升该品种质量标 准、保障产品质量，提供一种可靠的检测方法。 参考文献( 略) 川贝母的性状鉴别与分子鉴定方法分析比较。 苏畅1 2 “王淑红1 t 2 王铁杰1 2 宋茜1 ，2 陈太权3 ( 1 深l j l I 市药品

4、检验所。深圳5 1 8 0 5 7 ：2 深圳药品质量标准研究重点实验室，深圳5 1 8 0 5 7 ； 3 广东医学院东莞校区东莞5 2 3 8 0 0 ) 摘要：目的比较市售川贝母个体的性状与分子特征的差异，探讨川贝母性状鉴别与分子鉴定方法各自的判别优 势。方法对川贝母样品进行性状鉴定并按性状分组，采用P C R - R F L P 技术对每组的川贝母个体进行D N A 分子 鉴定。结果相同性状分组的不同实验个体在D N A 条带和形态特征方面存在差异。结论分子鉴定方法可准确鉴 定川贝母的真伪，但需结合形状鉴别方法进行综合判定，仅靠性状鉴定可能导致误判。 关键词：川贝母：中国药典；分子鉴定

5、：性状鉴别 I d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i so nr e t a i lC h u a n b e i m u ( F r i t i l l a r i a c i r r h o s a ) b a s e do nm o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o na n dm a c r o s c o p i c a l ” l n l o r m a n o n S UC h a n 9 1 ，- ，W A N GS h u - h o n 9 1 - ，W A N GT i e -

6、j i e L 2 ，S O N GQ i a n l ，- ，C H E NT a i - q u a n 3 ( 1S h e n z h e nI n s t i t u t ef o rD r u gC o n t r o l ，S h e n z h e n ，5 1 8 0 5 7 ；2S h e n z h e nK e yL a b o r a t o r yo f D r u gQ u a l i t yS t a n d a r d R e s e a r c h , S h e n z h e n , 51 8 0 5 7 ；3G u a n g d o n gM e d

7、 i c a lC o l l e g eD o n g g u a nc a m p u s ，D o n g g u a n ，5 2 3 8 0 0 ) A b s t r a c t ：0 b j e c tT oa n a l y z et h ec h a r a c t e r i s t i c sa n dd i f f e r e n t i a t i o no f t h er e t a i lC h u a n b e i m u ( F r i t i l l a r i ac i r r h o s a lb 舔e d o nm o l e c u l a ra

8、 u t h e n t i c a t i o na n dm a c r o s c o p i c a li n f o r m a t i o n , a n dd i s c u s st h es u p e f i o r i t yo f e a c ht e s t i n gm e t h o d M e t h o d s I n d i v i d u a lb u l bw a sg r o u p e db ym a c r o s c o p i c a li d e n t i f i c a t i o n ，a n dW a su s e df o rm o

9、 l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o nb yt h em e t h o d o fP C R - R F L PR e s u l t sB u l b si nt l l es a m em a e r o s c o p i c a lg r o u pp r e s e n t e dd i f f e r e n ti n f o r m a t i o ni nn u c l e o f i d ea n d m a c r o s c o p i c a lc h a r a c t e r i s t i C S C o n c l

10、u s i o nM o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o nb a s e do nm a c r o s c o p i c a li d e n t i f i c a t i o ni Sa ne 伍c i e n t m e t h o df o rC h i n e s eh e r bt e s t i n gw o r k K e yw o r d s ：C h u a n b e i m u ( F r i t i l l a r i ac i r r h o s a ) ：C h i n e s eP h a r m a c o

11、p o e i a ；m o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o n ：m a c r o s c o p i e a l I d e n t i f i c a t i o n 川贝母是具有代表性的川产道地名贵药材，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈之功效。 现代研究表明川贝母有镇咳、祛痰、抗菌等生物活性【1 , 2 1 ，但也有研究指出不同基源川贝母镇 2 6 1 中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集 咳、祛痰效果存在着差异pJ 。中国药典2 0 1 0 年版中收录的川贝母为百合科( L i l i a c e a e ) 贝母 属( F r

12、 i f i l l a r i aL ) 多种植物的干燥鳞茎，其基源植物多达有6 种，分别是川贝母( F r i t i l l a r i a c i r r h o s aD D o n ) 、暗紫贝母( F r i t i l l a r i au n i b r a c t e a t aH s i a oe tK C H s i O 、甘肃贝母( F r i t i l l a r i a p ，z e w a b M iM a x i m ) 、梭砂贝母( F r i t i l l a r i ad e l a v a y iF r a n c h ) 、太白贝母( F r i

13、 t i l l a r i at a i p a i e n s i s P Y L i ) 和瓦布贝母( F r i t i l l a r i au n i b r a c t e a t aH s i a oe tK C H s i av a r w a b u e n s i s ( S Y T a n ge t S C Y u e ) z D L i u S W a n ge tS C C h e n ) 【4 J 。据统计目前以川贝母为原料生产的中成药多达2 0 0 种 【5 J ，如川贝枇杷糖浆、蛇胆川贝散等，市场每年对川贝母的需求量巨大，价格逐年攀升，因此市 售川贝母的基源复

14、杂情况在所难免。 传统川贝母药材以野生为主，随着人工培育技术的发展，目前人工栽培的川贝母已成为市 售主要来源，栽培品种与野生种虽然种属一致，但其外观已经与传统野生的川贝母存在较大的 差异，同时人工栽培川贝母之间在鳞茎高、直径和单粒质量存在明显差异1 6 J ，因此在一线检验工 作中，必须借助丰富的资源考察经历和检验经验才能准确鉴别区分。另一方面贝母属植物众 多，具有6 0 个种、4 5 个变种、5 种变型，在不同地区许多贝母属植物的鳞茎也当做“贝母”入 药，它们虽与川贝母科属近缘、形态相似，但这些“贝母”的药用历史、药理作用、临床疗效皆 有别于正宗川贝母。目前在流通领域将廉价的其他“贝母”充当

15、川贝母入药的现象十分严重，如 何鉴别不同种类的贝母药材商品时中药鉴定的难点之一【7 J 。 川贝母常用的鉴别方法以性状鉴别和色谱鉴别为主，但由于川贝母近缘品种形态相似，市 售样品掺伪现象严重，因此常用的鉴别方法都存在一定的局限性，无法对市售川贝母复杂掺伪 现状进行准确鉴别。中国药典2 0 1 0 年版一部增补本中新增了川贝母P C R R F L P 鉴别，该方法 具有灵敏度高和准确度高的特点，己广泛应用于疾控、法医等各相关领域。但是该方法在中药 鉴定领域的应用仍存在某些需要改进的问题，如种子类掺伪样品的取样原则等。本文将以每粒 市售川贝母个体为研究对象，首先采用性状鉴别的方法对收集样品进行性

16、状分类，再运用中 国药典收载川贝母的P C R R F L P 法进行分子鉴定分析，最后通过分子鉴定检验结果，重新寻 找分类组内的性状差异。 1 实验材料 1 1 样品 实验样品均为深圳市售的抽检样品，按照其性状特征，分为A 、B 两组，每组选择三粒个 体进行实验。样品信息列表如下： 表1 川贝母样品收集表 旦曼! ! ! 丛竺翌! ! Q 趔! 型g ! 箜堑堑! 堂i 塑旦丝笪篁! 璺婴巳坦! 编号性状分类 C o d e M a c r o s c o p i c a lC l a s s i f i c a t i o n 0 3 0 1A 0 3 0 2A 0 3 0 3A 0 3

17、0 4 B 0 3 0 5B 0 3 0 6 B 1 2 仪器 V e r i t iP C R 仪( L i f eT e c h n o l o g i e s ) ；N a n o d r o p2 0 0 0 核酸蛋白分析仪( T h e r m o ) ；X S 2 0 5 电子天 平( M e t t l e r T o l e d o ) ；G B O XF 3 凝胶成像系统( S y n g e n e ) ；电泳系统( B i o m d P o w e r P a cB a s i c ) ； M M 4 0 0 球磨粉碎机( R e t s c h ) ：M B 1 0

18、2 恒温金属浴( 博日科技) ：系列微量移液器：E p p e n d o r f r e s e a r c h 。 1 3 试剂 中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集 植物基因组D N A 提取试剂盒( 天根生化科技) ；5 x p r i m eS T A R T a q 酶反应体系( T A K A R A ) ； S m aI 限制性内切酶反应体系( T A K A R A ) ；合成引物C B M - F 、C B M - R ( 华大基因) ；D L l 0 0 0 D N A 分子量标记( T A K A R A ) ；5 0 x T A E 电泳缓冲液、G e lr

19、e d 染料、巯基乙醇、琼脂糖等其他试剂 均为分子生物学用试剂。 2 方法 2 1 模板D N A 的制备 用刀片切取药材中嫩芽部分，用医用酒精棉擦拭药材表面进行消毒，室温放置1 h ，使药材 表面的乙醇充分散尽。样品放入2 m l 离心管中，加入钢珠，盖紧离心管。将离心管放入球磨粉 碎仪中，将药材粉碎至细粉。称取样品细粉2 0m g ，按植物基因组D N A 提取试剂盒说明书进行 操作，制得供试品模板D N A 溶液。另取川贝母对照药材O 1 9 同法制成对照药材模板D N A 溶 液。 2 2D N A 纯度检测 用核酸蛋白分析仪对所得的模板D N A 进行纯度和浓度的检测。 2 3P C

20、 R 引物 按照中国药典2 0 1 0 年版第一增补本川贝母【聚合酶链式反应限制性内切酶长度多态性】 ( P C R R F L P ) 法中的鉴别引物合成引物序列：C B M F ( C G T A A C A A G G T T T C C G T A G G T G A A ) ， C B M R ( G C T A C G T 陀T T C A T C G A T ) 进行P C R 扩增。 2 3P C R - R F L P 反应条件及鉴定 参照中国药典2 0 1 0 年版第一增补本川贝母P C R R F L P 鉴别法，P C R 反应体系：在2 0 0 L P C R 管中进

21、行，反应总体积为3 0 皿，反应体系包括5 x P C R 缓冲液6 此，2 5 m m o l Ld N T P2 5 此， 引物( 1 0 m o l L ) 0 5 此，高保真T a q D N A 聚合酶( 5 U p L ) 0 2 皿，模板D N A 溶液2 p L ，用无菌超 纯水补足至3 0 儿。P C R 扩增反应条件为9 5 “ C 预变性4 分钟，循环反应3 0 次( 9 5 变性3 0 秒， 5 5 复性3 0 秒，7 2 延伸3 0 秒) ，7 2 延伸5 分钟。R F L P 反应：在2 0 0 1 t LP C R 管中进行，反应 总体积为2 0 此，1 0 x

22、酶切缓冲液：2 p l ，P C R 反应液：6 此，S m aI ( 2 0 u 山) ：0 5 p L ，0 1 B S A 溶 液：2 皿，无菌超纯水补足至2 0 此，将样品放入P C R 仪，3 0 酶切反应2 小时。另取无菌超纯水荣 发制成空白对照溶液。电泳检测P C R R F L P 反应产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳分析，用G B O XF 3 凝胶成像系统检测。 3 结果 3 1P C R - R F L P 反应 参照中国药典2 0 1 0 年版第一增补本川贝母P C R R F L P 鉴定法，结果表明挑选的6 粒个体 中，编号为0 3 0 2 、0 3 0 3 、0 3

23、0 4 和0 3 0 6 的样品在与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应位置，在 1 0 0 2 5 0 b p 均呈现两条D N A 条带，空白对照无条带。但是编号为0 3 0 1 ( A 组) 和0 3 0 5 ( B 组) 的样品的凝胶电泳图谱仅在2 5 0 b p 处均呈现一条D N A 条带，与川贝母对照药材凝胶电泳图谱不一 致。结果见图l 。由此判定编号为0 3 0 1 和0 3 0 5 的样品为川贝母伪品。对比0 3 0 1 和0 3 0 5 样品酶切 前后的电泳图谱，结果表明2 5 0 b p 处的D N A 条带由P C R 反应产生，限制性内切酶S m aI 对此P C R 扩增

24、条带未能进行酶切反应，表明该条带不含有C C C G G G 的酶切位点。 3 2 性状分析 比较6 粒个体样品的性状特征( 见图2 ) ，分类A 组中0 3 0 1 号样品呈短圆柱形，基部尖，不 能竖立，与分类A 组中其他样品性状明显不同；分类B 组中0 3 0 5 号样品的外层鳞叶2 瓣，大小相 近，顶部开裂，心芽外露，与分类B 组中其他样品性状明显不同。( 见表1 ) 中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集 S1M234567M A B MD N A 分子量标记( 从上至下条带分子量依次为1 0 0 0 b p 、7 0 0 b p 、5 0 0 b p 、4 0 0 b p 、3

25、 0 0 b p 、 2 0 0 b p 、1 0 0 b p ) ：1 3 A 组( 0 3 0 1 、0 3 0 2 、0 3 0 3 ) ；5 7B 组( 0 3 0 4 、0 3 0 5 、0 3 0 6 ) ；4 空白对 照。 MD N A M a r k e r ( 1 0 0 0 b p 、7 0 0 b p 、5 0 0 b p 、4 0 0 b p 、3 0 0 b p 、2 0 0 b p 、1 0 0 b pf r o mt o p t ob o s o m ) ；l 3 G r o u pA ( 0 3 0 1 、0 3 0 2 、0 3 0 3 ) ；5 7G r o

26、 u pA ( 0 3 0 4 、0 3 0 5 、0 3 0 6 ) ；4B l a n k 。 图1 实验样品P C R R F L P 反应产物电泳图 F i g 1 P C R - R F L Pe l e c t r o p h o r o g r a mo f t e s t i n gs a m p l e s 123456 AB l 3A 组( 0 3 0 1 、0 3 0 2 、0 3 0 3 ) ；4 - - 6B 组( 0 3 0 4 、0 3 0 5 、0 3 0 6 ) ； 1 3G r o u p A ( 0 3 0 l 、0 3 0 2 、0 3 0 3 ) ；4

27、 6G r o u p A ( 0 3 0 4 、0 3 0 5 、0 3 0 6 ) 。 图2 实验样品性状图 F i g 2M a c r o s c o p i e a la p p e a r a n c eo f t e s t i n gs a m p l e s 表l 各实验样品性状鉴别特征 ：! 垒垒! 曼!丛垒璺塑兰鱼旦巳i 堡垒! i 堂望垡鱼竺堕i Q 璺i 望! 垒望里型i Q 垒Q ! 堡塾i 里g 兰璺婴巳! 曼兰 项目0301 0 3 0 20 3 0 30 3 0 4 、0 3 0 6 0 3 0 5 中华中医药学会第七次中药分析学术交流会论文集 一_ _ ，-

28、 - _ _ _ - _ _ 一 基部基部尖，不能竖立 基部平，中央微基部平，中央基部平 基部平 凹，能竖立微凹，能竖立 4 讨论 传统的贝母类药材鉴别主要采用性状鉴别和色谱鉴别的方法，贝母属植物种类繁多，不同基 源的“贝母，药材大多具有相似的性状特征，而同一基源的川贝母也会因产地不同导致性状存在差 别，给川贝母的性状鉴别带来了极大困难。另一方面野生品种的资源匮乏和人工栽培技术的发 展，使得目前市售川贝母基本以栽培品为主。由于中国药典中对川贝母的性状描述是基于野 生资源，因此能够符合典型特征描述的市售川贝母样品己十分罕见，川贝母的性状鉴别存在明显 的局限性，已经无法准确判别药材真伪。 近年来，

29、随着理化学科及分子生物学的不断发展，涌现出了许多新的鉴定技术和方法，其中 基于遗传物质D N A 分子鉴定技术，具有稳定、可靠、不受外界影响的特点，是中药鉴定领域研究 新热剧8 、9 】。中国药典2 0 1 0 年版收载了三种中药饮片的分子鉴定方法，使中药分子鉴定方法研 究步入了质量标准化阶段，但该方法在种子类掺伪样品的未规定取样原则，因此在日常检验中常 常出现性状鉴别与分子鉴定结果的差异，现行药典的分子鉴定方法仍存在某些存在改进的空间。 本研究是基于现行中国药典中对川贝母的性状鉴定和分子鉴定方法，以市售川贝母为研 究对象，首先运用性状鉴别方法将样品细分成不同的性状组，确保分子鉴定结果的代表性

30、；再从 每组中选择3 个不同的川贝母个体，运用P C R R F L P 法进行分子鉴定，用以验证性状结果的准确 性。结果显示同一性状分组中的不同个体均存在伪品，分子鉴定检验结果与性状鉴别结果产生了 分歧。最后对比每粒个体在实验前保存的性状图像信息，重新论证分类组内的性状差异，最终得 出川贝母样品的真伪鉴别结果。 中药的基源鉴别与真伪鉴定是质量评价及其药学相关研究的前提和基础，在中药日常检验 中，对于个体较小的中药材( 如鳞茎、种子类药材) 经常发现掺伪的现象。对于这类样品的分子 鉴定一定要确保取样具有代表性。本实验通过性状分组与个体取样的方式，有效确保了个体较小 的中药材的取样代表性阅题。同

31、时由于个体较小的中药材在分子鉴定后外观性状己被破坏，当分 子鉴定结果与性状鉴别结果出现差异时，无法对样品的性状特征进行二次分析，因此在实验前应 保留每粒鉴定个体完整的性状图像信息，并重新论证分类组内的细微性状差异，有效确保了性状 鉴别的准确性。本研究的结果还表明：性状鉴定与分子鉴定都存在一定的局限性，日常检验中必 须发挥二者的特点和优势，相辅相成，最终得出相对客观的检验结论。本研究建立的川贝母药材 的检验模式，也可应用于其他个体较小的中药材，并对日常的检验工作具有重要的意义。 参考文献( 略) 雪菊中异奥卡宁葡萄糖苷的T L C 鉴别和U P L C 含量测定 崔庆玲1 。潘英妮1 牛立营1

32、，倪慧2 ，李宁1 ，刘晓秋卜 ( 1 沈阳药科大学中药学院。辽宁沈阳l 1 0 0 1 6 ； 2 新疆维吾尔白治区中药民族药研究所，新疆鸟鲁木齐8 3 0 0 0 2 ) 摘要：目的考察花荼- 雪菊的质量，建立质量评价方法。方法：建立了雪菊中异奥卡宁葡萄糖苷的T L C 鉴别法和 U P L C 含量测定法，测定了1 0 批样品中异奥卡宁葡萄糖苷含量。结果：T L C 图谱中，在各样品中均可栓视出异奥 卡宁葡萄糖苷的斑点：U P L C 测定法中，异奥卡宁葡萄糖苷色谱峰分离度好，在5 1 0 4 0 8m g L 。范围内线性关系 良好，回收率为9 8 7 ( R S D I 7 ) ，在

33、1 0 批样品中异奥卡宁葡萄糖苷含量范围在0 3 6 1 0 6 8 1 。结论：本研 究为雪菊质量评价体系的建立和进一步药用开发提供理论和实验依据。 关键词：雪菊；质量评价：T L C ：U P L C ：异奥卡宁葡萄耱苷 中图分类号：R 9 1 7 文献标志码：A S t u d i e so nt h eT L Ci d e n t i 6 c a t i o na n dt h ec o n t e n to fi s o o k a n i n 7 O p - D g h l c o p y r a n o s i d ef r o mC o r e o p s i st i n c t o r i a 通讯作者T e l ：0 2 4 - 2 3 9 8 6 4 6 9 ；E - m a i l ：l i u x i a o q i u 3 3 8 8 1 2 6 c o m 第一作者崔庆玲T e l ：1 8 6 4 0 4 8 8 0 6 5 ；E - m a r l ：c u i q i n g l i n 9 0 3 0 5 1 6 3 c o m 2 6 5