维生素a对肉牛肌内脂肪沉积及acchsl、pparγ基因表达的影响1.pdf

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1、维生素A 对肉牛肌内脂肪沉积及A C C / H S L , P P A R Y 基因表达的影响 摘要 通过体内和体外 3 个试验研究添加维生素 A ( V A) 对杂交育肥肉牛肌内脂肪沉积及 脂肪酸合成限速酶A C C , 脂肪动员分解限速酶H S L , 脂肪细胞分化关键调榨因子P P A R 丫 基因表达的影响口 试验一:选用 1 6 头体重约3 5 0 k g 的健康利木赞X 鲁西黄牛杂交 一 代育肥肉 牛，随 机分为4 个处理，每个处理4 个重复，分别饲喂添加不同浓度V A的日 粮。V A添加水 平分别为饲养标准的0 % , 5 0 %, 1 0 0 % 和2 0 0 %( 饲养标准

2、为2 2 0 0 1 U / k g 饲料于物质) ， 以未添加V 人的处理作为对照组， 侮月称重， 饲养 6 个月后侮组挑选 3 头屠宰， 取西冷、 臀中肌，测定肌内脂肪含量。结果表明，V A添加水平为5 0 %的处理组体重增加明显高 于对照组和其它处理组 ( P 0 . 0 5 ) ; V A 添加量最高组西冷肌脂肪含量明显低于对照组 ( P 0 .0 5 ); 三种不同形式V A的添加浓度为5 , 2 5 , 1 0 0 p g / d L 时 一 ， 脂肪细胞 P P A R y 的 表达量都明显低于对照组 ( P 0 .0 5 ) . A l l o f t r e a t m e

3、n t s w it h V A h a d m u c h l o w e r P P A R 丫m R N A l e v e l t h a n t h e c o n t r o l ( P 属于类固醇/ 甲 状腺激素核受体超家族成员， 并各有3 种不同亚型。 它们通 过形成异源二聚体 ( R A R I R X R )与全反视黄酸结合激活 R A R ，或形成同源二聚体 ( R ) R / R X R )与9 - 顺视黄酸结合激活R X R ，激活的R A R或R X R与靶基因启动子附近 的 视黄酸应答元件相互作用， 进而起到调控靶基因的 转录与表达的 作用。 这些靶基因的 编码产

4、物包括参与细胞组织形成的结构蛋白， 参与代谢及调节的酶， 或者调节下级基因 表达的调节蛋白，以此发挥视黄酸类物质的湃布式调节功能。 R X R还能与过氧化物酶 体增殖物激活受体 ( P P A R )结合形成异源二聚体， 参与脂肪细胞分化的调控。 视黄酸影响细胞分化的另外一个途径是形成视黄酞基化的蛋白 质， 在一些分化了的 细胞核中证明 酞基化蛋白 质的大小与与核受体相同， 由 于某些蛋白 质与特定的脂肪细胞 的酞化作用可明显影响它们的功能，所以视黄酸在脂肪细胞的分化中具有一定的作用。 1 .2 .4维生素A 对牛肉品质的影响 影 响 牛肉 品 质的 主 要 指 标 有 肌内 脂 肪f9 ,

5、1 0 1 、 肌肉 色 泽I 1 1 , 1 2 1 、 风 味I 1 3 , 1 4 1 、 微 生 物、 脂 肪 氧 化i 1 5 , 1 6 1 、 系 水 力 等。 因 此， 凡 是 能 影 响 上 述 指 标的 因 素 都影 响 牛肉 的 品 质， 维生素A对肉牛)U 内脂肪沉积及A C C / H S L , I P A R y 基闪表达的影响 如动物木身、饲料、饲养管理和加 屠宰方法等。 肌内脂肪在肌肉组织 ! ， 分布形成的可见斑点，形似人理石的花纹，是衡量牛肉， 胡 贡 的重 要指标， 它不仅有助于 牛肉 的嫩度和风味1 1 7 , 2 1影 响牛肉的，W : 质等级1 1

6、 8 , 1 9 1 ， 还 直接影响视觉感官， 是消费 者作出 购买决定的主要 依据之一f 2 0 1肌内 脂肪肌内 脂肪是 山肌内脂肪组织和肌纤维中的脂肪组成的， 肌细胞中脂肪滴的比例和分布是决定牛肉大 理石花纹等级的 主要因素 2 1 1膜L . 11旨 肪对大 理石花纹影响 较小。当 肌内 脂肪达到一定 的比例时牛肉断面呈现大理石花纹，这样的牛肉鲜嫩、柔软、多汁，是理想的肉品。大 理石花纹一般根据 1 2 和1 3 肋间处眼肌切面的可见脂肪的多少划分等级， 划分标准因国 家而异，如日本划分为9 个等级，以一 级为最好。 对牛肉品质影响的研究主要集中在遗传和营养两个方面。 遗传方而现已取

7、得了显著 进展，研究基本确定了脂肪细胞发育的途径和调节机制。 在营养方面人们也进行了大量 的试验， 研究表明饲料的种类和所含的营养成分都影响牛肉的品质，其中维生素由于具 有微量、对人体健康有益的优点而受到越来越多的关注，然而V A影响牛肉品质的报道 却很少，目前对 V A的研究主要集中于V A在维持机体正常的视觉、繁嫩、免疫和上皮 完整等方面的作用。一些对小鼠和肉鸡研究的表明，当V A缺乏或过量时易导致机体组 织 的 细 胞 膜 流 动 性 下 降 (2 2 1 脂 过 氧 化 物 含 量 升高 12 3 . 2 1 1 添 加V A 能 抑 制 细 胞 膜 上 磷 脂 和 蛋自 质的 氧化2

8、 5 1 ， 但这 种 影 响 作用 机理 还不 清楚。 I 粮 含有大 剂量V A会显 著降 低 V E 的 1吸 收 (2 6 . 2 9 1 V A具有类激素的活性，这可能与肉牛的脂肪代谢密切相关，但目前V A对牛肉肌 内脂肪的影响的试验很少，而V A发挥作用的机理、添加的剂量等更是少有报道。 大部 分 的 研 究 认 为 ， V A具 有 抑 制 脂 肪 细 胞 分 化 的 作 用 ， 但 是J u m p 12 8 1 体 外 培 养 小 鼠 脂 肪 细 胞研究发现， 视黄酸对脂肪细胞大部分基因的表达具有明显的促进作用， 但对脱氢酶类 基因具有抑制作用，不同的研究结果可能和V ) 、

9、 的添加量有关。视黄酸具有诱导谷肌甘 肤过氧化物酶合成的作用， 而高V A日 粮可能抑制日 粮中维生素E 和维生素D的吸收和 存贮，因此，适当减少添加V A可能促进V E的吸收，间接改善肉 质延长肉的保质期， 但长 期的低V A可能会破坏上皮细胞的完整性损伤， 使小 肠粘膜受损。 V A是肉牛必需的维生素之一，其来源有两个，一 是饲料中添加的V A经小肠吸收 后进入体内， 二是由 饲料中的p 一 胡萝卜 素转化而来， 饲料中的0 一 胡萝卜 素经吸收后大 部分在小肠薪膜内山1 5 , 1 5 一 双加氧酶催化断裂成V A .p 一 胡萝卜 素转化为V A的效率 差异很 大， 因 此， 在 有关

10、V A的 研究中 需尽量消除p 一 胡 萝卜 素的 干 扰。p 一 胡萝卜 素 对 牛肉品 质的有着显著影响，主要是着色作用和抗氧化作用。吸收的s 一 胡 萝卜 素在牛体 内 主 要 沉 积 于 脂 肪 组 织 中， 使 体 脂 变 黄 2 9 1 0p 一 胡 萝卜 素 具 有 较 强 的 抗 氧 化 活 性， 它 可 以 有效的淬灭单线态氧自由基， 降低脂类的过氧化作用， 但其抗氧化的机理月前仍不清 楚。由 于日 胡萝卜 素极易使体脂肪变黄而降低牛肉的等级， 特别是高档牛肉生产中， 育肥后期应尽量减少饲料中s - 胡萝卜 素的使用。 第一章 文献综述 1 . 3脂肪代谢限 速酶基因A C

11、C I H S L 和调控因子P P A R Y 的研究进展 动物的代谢活动包括物质代谢和能量代谢两方面，这些代谢的物质基础来源于日 粮， 所以日 粮中的各种营养成分在动物的生命活动中 起了 极为重要的作用。己有研究表 明:日 粮中的主要营养物质包括一些维生素与矿物质， 对许多基因的表达都有影响， 其 中包括一些关键的代谢酶和调控因子的基因。 营养物质对基因表达的影响是指动物摄入 的营养物质经过一系列的转运及信号传递过程将信号传递到细胞质或细胞核， 与其它要 素一起调节染色质的活化、基因的转录、m R N A 的稳定性及其翻译的过程。根据目前的 研究进展来看， 一般认为， 由日 粮配合而实现的

12、营养素对基因表达的调控多为转录水平 的调控，即从D N A 的转录到m R N A 的稳定性这一水平。 1 . 3 . 1动物的脂肪组织和脂肪代谢及调控 动物主要组织的生长发育中， 脂肪是最晚发育的组织， 动物脂肪沉积的先后顺序一 般是腹脂、皮下脂肪和肌间及肌内脂肪，脂肪组织主要是由脂肪细胞、脂肪前体细胞、 微血管内 皮细胞和细胞外基质等组成， 动物出生后初期其脂肪组织主要以细胞体积的增 大为主， 在后期或成年期以细胞数量的增长为主。脂肪组织具有参与机体产热调节，对 组 织器官 起衬托和 保护的 作用， 并维 护动 物体能 量 代谢平 衡i 3 0 , 3 1 1 甘油三酣 IN A 4 3

13、一 一磷 。 甘油- * - - y/、 游离脂肪酸 /汉A S G 6 P D H / * - -N A D P H一葡萄塘 5 / 2 1 A c , O F C D H今 I I乙酸I LP L 血掖/ 声 甘油N E F A V L D L乙 酸葡萄糖 甘油三醋 图1 - 3反自动物 脂肪组织代谢途径(3 2 1 F i g u r e 1 - 3 : T h e m e t a b o l i s m o f a d i p o s e t i s s u e i n r u m i n a n t a n i m a l 1 . 脂肪酸合成; 2 . 内 源甘油三醋的水解和吸收;

14、3 . 脂肪酸的酷化; 4 . 脂解作用: 5 . 脂肪动员: V OL 极低密度脂蛋白: A C C : 乙 酸辅酶A 狡化碗; G 6 P D H : 6 - 确酸葡萄箱脱氮硫: H S L : 激素敏感丽 酶; I C D H : N A D P 一 异柠橡酸脱氮酶;L P L :脂蛋白脂酶:0 3 P D H : 3 - 磷酸菊萄粉脱氮酶;N E F A :非醋化脂肪酸 家畜9 5 %月 旨 肪是在脂肪组织中合成的，其余约5 %的脂肪在肝脏合成，反自动物瘤 胃吸收的乙酸是合成脂肪的主要来源 ( 图1 - 3 ) ， 乙酸可直接进入胞液转变成乙酞辅酶A, 第一章 文献综述 实时定量P C

15、 R 技术中有两个很重要的概念: 荧光闽值和C T 值。 荧光阐值一般默认为 3 1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍，每个P C R 反应管内的荧光信号到达设定闽 值时所经历的 循环数称为C 丁 值。 C T 值与 对应模板的起始拷贝 数的对数存在线性关系。 实 时定 量 P C R 正是 利用扩增进入指数增长初 期时的 C T 值来定量起始模板的量 1 1 7 1 ， 以克 服 传统P C R 固有的平台效应，达到极为精确的核酸定量检测。 目 前它作为一个极有效的实验方法，被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域， 同时也作为一种诊断手段应用于临床诊断、药物研究等，其涉及的应用主要

16、包括D N A 或R N A 的定量、基因突变分析、基因表达差异分析、基因分型等。 1 .4 .2实时定量P C R 技术的 特点 实时定量P C R 技术是P C R 技术、光谱技术和计算机技术的有机结合，所以 具有许多 普通P C R 所不具备的优点。 首先实时定量P C R 技术操作简便、 快速高效，具有很高的敏感性和特异性，对基因 组 D N A 而言 ， 实时 定 量 P C R 最 低 检出 限 一 般在1 0 - 1 5 , 1 0 “ 12 9 级， 对于 病毒、 质 粒而 言， 其检出 限 一 般 在1 0 2. 1 护 拷贝 数以 上 1 1 8 1 : 其次 定量 P C

17、 R 反 应是 在一 个 封闭 系 统中自 动 完成的，可以有效避免污染，并且无需扩增后的凝胶电泳操作;另外，它还可以通过不 同 的引 物设 计在同一反 应体系中同时 对多个 靶基因分子 进行扩增定 量 1 1 s . 1 2 0 1 1 .4 . 3实时定量P C R 的荧光化学 实时定量P C R 的化学原理包括非探针类和探针类， 非探针类利用染料或者特殊设计 的引物来指示扩增的增加， 探针类则是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的 增加。两者都是通过荧光染料或荧光探针在反应过程中的变化来收集荧光信号。 1 . 4 . 3 . 1荧光染料 荧 光 染料 指的 是 一 种能与D N A

18、双 链结 构中 的 小 沟 结 合的S Y B R G r e e n I 染 料! 1 2 1 1 在P C R反应体系中，加入过量S Y B R荧光染料，随着反应的进行S Y B R荧光染料特异 性地掺入D N A双链，发射荧光信号，而未掺入链中游离的S Y B R染料分子不会发射任 何荧光信号，从而保证了荧光信号的增加与P C R产物的增加完全同步。 S Y B R G re e n I 在核酸检测方面有许多优点，由于它与所有双链D N A相结合，不必 因为模板的不同而特别定制，所以设计的程序通用性好;利用荧光染料可以指示双链 D N A熔点的性质，通过熔解曲线分析可以识别扩增产物和引物

19、二聚体，以区分非特异 性扩增;还可以进一步实现单色多重测定，此外，由于一个 P C R产物可以 与多个分子 的染料结合，因此S Y B R G r e e n I 灵敏度很高。但是由于S Y 13 R荧光染料能与所有的双 链D N A结合，由引物二聚体、非特异扩增引起的假阳性会影响定量的精确性，所以设 计选择良 好的引物优化反应条件， 通过融解曲线分析避免S Y B R荧光染料的非特异结合 是必须的。 维生素A对肉牛肌内脂肪沉积及A C C / H S L , P P A R y 基因表达的影响 1 . 4 .3 . 2荧光探针 荧光探针中 最常用的是T a g M a n 探针， 它是与目

20、标基因上下游引物之间 序列配对的 寡核昔酸序列 fi z z l e P C R 扩增时 在加入一 对引 物的同 时 加入一 个特异性的荧光探针， 探 针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团， 探针完整时由于发生能量传递 作用，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，报告基团不发出荧光，P C R扩增时， T a q 酶的5 外切酶活性将探针酶切， 报告基团随着探针的水解而脱落， 使报告 报告基团 和淬灭基团分离。随着扩增循环数的增加， 释放的荧光基团不断积累，因此荧光强度与 扩增产物的 数量呈正比关系。T a g M a n探针的优点是不受引物二聚体及非特异性扩增的 影响，特异性比较

21、高。 其它常用的一种荧光探针是分子信标 ( m o le c u l a r b e a c o n )，它是一种在靶D N A不 存在时形成茎环结构的 双标记寡核营酸探针， 原理类似T a g M a n 探针， 都是通过报告 基 团和淬灭基团的作用产生荧光。分子信标特别适合于检测点突变。 其它如杂交探针、 T a g M a n M G B探针、L U X引 物也同 样应用于实时定量P C R . 1 . 4 . 4实时定量方法的选择 对于D N A或R N A的常规定量来说， 有两种定量方法: 绝对定量和相对定量。 绝对 定量一般通过标准曲线来确定模板的精确拷贝数， 直接反应结果的大小;

22、 而相对定量一 般是用来确定经过不同处理的样品目 标转录本之间的表达差异， 它不必测定模板的精确 拷贝数。一般对于比较处理之间基因表达的差异，用相对定量的方法更加直观。 1 . 4 . 4 . 1绝对定量 绝对定量就是用一系列己知浓度的标准品制作标准曲线， 在同等条件下目 标基因测 得的荧光信号同标准曲线进行比较， 从而得到目 标基因的拷贝数。 该标准品可以是纯化 的 质粒d s D N A ， 体外转 录的R N A ， 或 者是体外合成的s s D N A 1 2 3 1 。目 标基因与 标准品 在不同 的反 应管内 同 时 进行扩增， 使用的 荧光染 料有T a g M a n 探针、

23、S Y B R G r e e n I 等。 这一方法的动力学范围可以达到9 个数量级，远比终点法的要高。 绝对定量方法的前提是标准品与目 标基因的扩增效率一致， 其准确性往往依靠标准 品制备和贮存的好坏， 并尽可能地优化实验条件和模板的准备过程， 如采用竞争性P C R 的方法减少反应体系中的干扰因素。 1 . 4 . 4 . 2相对定量 所谓相对定量是指在测定目 标基因表达量的同时测定某一内源看家基因的表达量， 以看家基因作为标准比较样本来源不同的目标基因表达量的差异。 由于看家基因在各种组织中的表达是恒定的， 所以相对定量选择看家基因作为标准 计算目标基因的相对表达量，试验通常选用的看家

24、基因有 p - a c t i n , G A P D H和 1 8 s r R N A 1 1 8 1 。 看家基因主要作为内 对照用于核昔酸的拷贝数的比 较，它的另一个重要 第一章 文献综述 作用是作为内源性对照消除待测样本的体积变异、核酸抽提及 m R N A反转录过程中造 成的目标基因的变异，川以标准化标本，以及反映反应体系内是否存在 P C R扩 一 增的影 响因素 1 2 4 1 使用相对定量较为早期的方法是用一系列已知的外参照做标准曲线， 根据标准曲线 得到目 标基因和看家基因的量， 将目 标基因与 看家基因的比值作为定量的最后结果，这 一 方法要求外参、目 标基因和看家基因的扩

25、增效率一致。 除 了 这 种 常 用的 方 法 之 外， L i v a k 和S c h m it t g e n 1 1 8 1 设 计 了 一 种2 - A A C T 法 来 测 定目 标 基因的相对表达，根据 P C R指数扩增的公式: X = X o x (l + E , r ( X: 第n 个 循 环 后目 标 基因 拷贝 数;X u : 初 始目 标 基因 拷贝数;E s :目标基因扩增效率:n : P C R反应循环数:C T :目 标基因扩增产物达到 设定闽值所经历的循环数) 假设目 标基因和看家基因扩增效率一致， 推导得出: 处理组目标基因的表达相对于 对照组的 变化是2

26、 - e e c r ，其结果是一个比 值，其中: A A C T 二 (C “ Fl I, 二 二C r , :二 iA1 4i r4 a l C r .l11a;?7 0 %. 7 5 %乙醇用D E P C处理水配制;3 M乙 酸钠用D E P C处理水配制后， 用冰醋酸调整p H至5 .2 ，分装， 4 0 C保存。 2 . 2 .3 . 2反转录及P C R用品前处理 各种规格枪头按常规方法高压湿热灭菌 ( 1 2 1 0 C , 1 .2 MP a , 3 0 m i n ) , 烘 1 七 后即可使 用;用于定量P C R的9 6 孔板和光学贴膜拆开包装后直接使用。 2 . 2

27、.3 .2 D E P C处理水 ( 无R N A酶的超纯水)的配制 取 1 0 0 0 m L 超纯水，加1 m L D E P C( 1 %) ,剧烈震荡混匀， 3 7 0 C烘箱过夜，高压灭 菌除去D E P C ，冷却后用于试剂配制，并1 . 5 m L 分装若干， 4 0 C贮存，用于R N A纯化、 反转录。常规P C R和定量P C R使用普通灭菌超纯水。 2 . 2 .3 .3 E D T A溶液 ( 0 . 5 m o l/ L p H 8 . 0 )的配制 在8 0 0 m L D E P C处理水， 功 1 1 入1 8 6 . 1 g E D “C A - N a t

28、-2 H 2 0 ，边搅拌边加N a O H ,调W 溶液的p H值至8 .0( 约需2 0 g N a O H ) , 溶解并定容至I L ，分装，高 压灭菌备 用。 注: 加 入N a O H将溶 液的p H 值调节 至8 .0 时， E D T A - N a 2 刁能完全 溶解。 2 . 2 .3 . 4 T A E电 泳缓冲液 5 o x 贮存液)的配制 称取T r i s 碱2 4 2 g ， 用7 0 0 m L D E P C 处 理水 溶解， 加0 . 5 m o l / L p H 8 .0 的E D T A 溶 液1 0 0 m L ， 冰醋酸 5 7 . 1 m L ，

29、 定容至1 0 0 0 m L ，室温保存， 使用时用D E P C处理水稀释 成1 X T A E电 泳缓冲液。 2 . 2 .3 . 5澳化乙 锭 ( 1 0 侧m L ) 的 配制 在1 0 0 m L 超纯水中 加入1 g m 化乙 锭， 搅拌充分溶 解， 用 铝箔纸包裹不透光的小 瓶室温贮存。 2 . 2 .3 . 6引 物( l o o m) 的 溶解 以I O D 引 物 为 例， 溶 解引 物的 灭 菌 水 的 体 积= 1 O D X 3 3 u g / 引 物M Wx 1 0 5 o 山于引物以很轻的干膜状附于管底，打开时容易散失，所以打开离心管前先离心， 然后根据计算的灭

30、菌水的体积加入离心管， 充分振荡l O m i n 溶解，- 2 0 0 C 贮存。 注:1 O D O l ig o D N A的质量数为3 3 p g e 维生素A对肉牛肌内脂肪沉积及A C C / H S L , P P A R r 基P ll 表达的影响 2 . 2 .3 . 7琼脂糖凝胶的制备 ( 1 %) 称取0 . 3 g 琼脂糖，倒入二角瓶，加1 X T A E 3 0 m L ( 5 0 X T A E 1 O m L V D E P C处理 水4 9 0 m L混合) ， 微波炉加热融化， 反复沸腾至澄清， 避免液体喷出气角瓶， 冷却至6 0 0 C 左右 ( 不烫手) ，

31、 加1 . 5 t L E B ( 0 .5 p g/ n , L ) . 轻轻摇匀， 避免泡沫的产 L : . 缓缓倒入放有 梳子的胶床中，凝胶厚度约为 0 . 3 - 0 . 5 c m，若有泡沫，用枪头立即轻轻拨至胶床尾部挑 去，室温冷却凝结3 0 m i n ，轻轻拔去梳子，放入加有 I X T A E电泳缓冲液的电泳槽。试 验中用0 .8 - 1 % 琼脂糖检测总R N A完整性，用2 . 5 - 3 Yo琼脂糖检测P C R产物的特异性。 注:E B为强致癌物质。整个配胶及电泳过程戴一次性手套，但微波炉加热和凝胶成像 仪器操作时要求裸手，避免交叉污染。 2 .2 . 4肌肉组织总R

32、 N A的提取及纯化 肌肉 组织总R N A的 提取及纯化参考文 献 1 2 7 1 及总R N A 提取试剂盒 使)i l l 手 j 1 1 2 8 1 0 2 . 2 . 4 . 1总R N A提取注意事项: 1 . 所有用于R N A提取的试验用品必须经去R N as e 处理， 处理过的试验用品在一周内使 用，否则重新处理。 2 . 所有用于R N A提取的试剂必须用0 . 1 % D E P C处理水配制， 试剂配制好之后分装成 1 次性包装备用，以保证侮次试验使用新鲜的试剂。 3 . 使用专用的高纯度原料配制相关试剂，只使用处理过的一次性塑料制品和玻璃器皿。 4 . 谨防在试验用

33、品处理、 试剂配制及R N A提取过程中唾液、 汗液内的R N a s e 污染，必 须戴上一次性手套 ( 并经常更换)和口罩。 5 . 试剂盒及常规试剂4 0 C保存， 水饱和酚4 0 C避光保存， 酶制剂、 D N A , c D N A一2 0 0 C 保存，细胞消化样品、 R N A溶液一7 0 0 C保存，组织样品液氮保存。 6 . 整个R N A提取过程在冰浴中 进行，以降 低R N a s e 活性。 2 . 2 . 4 . 2总R N A的提取 1 . 样品的前处理 预 冷 组 织 匀 浆 器5 m i n ， 加6 0 0 t L 变性 液， 迅 速切 取 液 氮冻 存的 肌

34、肉 组 织7 08 0 m g , 放入组织匀浆器中， 研磨至匀浆液清亮，转移匀浆液至2 m L离心管，再 用4 0 0 t L 变性 液清洗研磨器，转移剩余组织匀浆液，整个过程以最快速度剪切研磨转移，防止 R N A 的降解。 2加2 M醋酸钠9 0 ji L , 颠倒离心管4 - 5 次， 混匀，再 加酚二 氯 仿: 异戊醇9 0 0 g L ， 小 心颠倒3 - 5 次，剧烈振摇 l o s ，此时溶液呈乳白色，置冰上1 5 m i n o 3 . 1 2 0 0 0 r p m 4 0 C 离心l 0 m i n ， 小心吸 取上层水相至 新的 离心管， 勿 吸取白 色分界 相及卜 面

35、的有机相，为了保证R N A质量，防止D N A的污染，多剩余一些水相。 4 ， 加等量预冷的异丙醇，一2 0 0 C沉淀R N A I h . 维生素A对肉牛 肌内 脂肪沉积及A C C / H S L . P P A R y 基因表达的影响 2 .3维生素A对肉牛体外培养脂肪细胞中脂肪代谢限速酶 ( A C C / H S L ) 及 调控因子P P A R Y 基因表达量的影响 2 . 3 . 1仪器设备和试剂 下面所列的主要是脂肪细胞培养使用的仪器设备和试剂， 其它分子生物学使用的仪 器设备和试剂见2 .2 .2 . 2 . 3 . 1 . 1主要仪器设备 C O : 培养箱 ( T

36、h e r m o F o r m a , Mo d e l 3 1 1 1 ) 、超净工作台 ( 哈东联， D L - C J - 2 N ) 、倒 W.相差显微镜( O l y m p u s , I X 7 1 ) 、 超纯水机( M i l l ip o r e , M i l l i - Q A l 0 ) , 超低温冰箱( T h e n -n o F o r m a , M o d e l 7 2 5 ) 、 无油真空泵 ( A u o t o s c i e n c e , A P - 0 1 13 ) 、电热鼓风干燥箱 ( 泰斯特， 1 0 1 - 3 A B ) 、电热恒温

37、水浴锅 ( 泰斯特，D K - 2 0 0 0 - I I I ) 、冰箱 ( 荣事达，B C D - 2 6 5 / E ) 、移 液管 用加 样器 ( F i n n p i p e t t e ) , 微量加样器 ( F i n n p i p e t t e , 1 0 - 1 0 0 p L , 2 0 0 - 1 0 0 0 p L ) ,高 压蒸汽灭菌锅 ( S a n y o , M L S - 3 7 8 0 ) 、天平 ( S a rt o r i u s ) 、常温低速离心机、 C 0 2 钢瓶。 2 . 3 . 1 . 2常规试验用品 4 7 m m磁性过滤漏斗 及滤膜

38、 ( 直径4 7 m m ， 孔径0 .2 p m ) ,比抽滤瓶、1 L 三角瓶、 可换 针式滤器 及滤膜 ( 直径2 5 m m ， 孔径0 . 2 p m ) 、 定量 加样器( I m L , 1 0 0 p L ) 、 血球计 数板、止血钳、眼科剪、 眼科镊、手术剪、手术刀及刀片、 尼龙膜 ( 孔径2 5 0 p m) ,盐 水瓶或硫酸瓶、平皿 ( 直径 6 0 m m ) 、各种规格血清瓶、 烧杯、容量瓶、l O m L和 5 m L 移液管、 p H试纸、 滴管、 酒精 灯、 酸 缸、 橡胶塞、 乳 胶管、 防酸手套、 离心管 架、 新 洁尔灭、铝饭盒、大保温瓶等。 2 . 3

39、. 1 . 3试剂 D M E M培养基、 F 1 2 培 养基、 胶原 酶I 为G i b c o 公司产品， 标准胎牛血 清为H y c lo n e 公司产品、胰蛋白 酶、D MS O( 二甲基亚枫)为 A m e r e s c 。公司产品、培养基中添加的 全反视黄酸、 视黄醇、 棕搁酸视黄酷、 胆固醉、 鞘磷脂、 生物素、 泛酸钙盐、牛胰岛素、 D E X( 地 塞 米松) 、 I B M X( 甲 基异 丁 基黄 嗦 岭) 、 辛 酸 钠、 转 铁蛋白 均为S ig m a 公司 的 产品，牛血清白 蛋白 购自 北京华绿渊生物技术有限公司、 H E P E S为R o c h e

40、公司 产品， 青霉素、 链霉素、 庆大霉素购自 药店，其它常规试剂重铬酸钾、浓硫酸、无水乙醇、硫 酸铜、台盼蓝等为国产分析纯。 2 . 3 . 1 . 4耗材 2 5 c m 2 培养瓶( C o s t a r ) , 3 5 m m培养皿( C o s t a r ) , 1 2 孔培养板( C o s t a r ) 、 枪头( 1 m L , 2 0 0 W L ) 、 离 心管( 1 . 5 m L、 1 5 m L , 5 0 m L ) 、 一次 性注射器( l O m L , 2 0 m L ) 、 乳胶手 套、 封口 膜、铝箔纸、脱脂棉、纱布、皮筋、牛皮纸等。 第_章 试验材

41、料与方法 2 .3 .2 溶液及试剂的配制 2 . 3 . 2 . 1 试验用品的前处理 1 . 玻璃器皿和塑料橡胶制品: 第一次使用的玻璃器皿先用洗涤剂清洗，烘干，5 %稀盐酸浸泡过夜，再用洗涤剂 清洗，烘干，然后铬酸洗液浸泡过夜 ( 至少6 小时以上) ，自 来水冲洗 1 5 次以上，蒸馏 水冲洗3 - 5 次， 超纯水冲洗1 次， 烘干， 铝箔纸和双层牛皮纸包装， 高压湿热灭菌( 1 2 1 0 C , 3 0 m i n ) ,烘干，备用。 使用过后的玻璃器皿直接清洗后浸泡铬酸洗液， 进口离心管和针式滤器可直接清洗 浸泡铬酸洗液， 然后按照程序清洗灭菌; 橡胶塞用稀盐酸浸泡后， 直接按

42、程序清洗灭菌。 2金属器械: 用洗涤剂刷洗，然后自 来水冲洗 1 5 次，燕馏水冲洗3 - 5 次，超纯水冲洗 I 次，烘 干包装，高压湿热灭菌，烘干备用。 2 .3 . 2 .2常规试剂的配制 1 . Na OH ( 1 M) 称取l O g N a O H ， 用灭菌 水溶解定容至5 0 m L ， 过滤除 菌， 分装， 4 0 C 贮 存。 2 . HC 1 ( 1 M) 吸取4 . 1 6 7 m L浓盐酸至5 0 m L容量瓶，灭菌水定容，过滤除菌，分装，4 0 C贮存。 3 . N a H C 0 3 ( 5 . 6 %) 称2 .8 g N a H C 0 3 ， 用灭菌 水溶解

43、定容 至5 0 m L ， 过滤除 菌， 分装， 4 0 C 贮存。 4铬酸洗液 ( 次强) 重铬酸钾1 2 0 g ， 加蒸馏水1 0 0 0 m L ， 加热搅拌溶解后缓慢加入浓硫酸2 0 0 m L , 混匀。 5 . 胶原酶I 溶液 ( 0 . 1 %) 1 0 0 m g 胶原 酶I ， 溶于适量无菌的D - H a n k s ， 并 定容至1 0 0 m L ， 用5 .6 % N a H C O 3 调节p H至7 .27 .4 ， 过滤除菌， 分装，- 2 0 0 C 贮存。 6 . 胰蛋白酶 ( 0 .2 5 %) 2 5 0 m g 胰蛋白 酶， 溶于 适量无菌的D -

44、H a n k s ， 并定 容至I O O m L ， 用5 . 6 % N a H C O 3 调节p H至7 . 58 . 0 ， 过滤除菌， 分装，- 2 0 0 C 贮存。 7 . 双抗母液 ( 1 0 万IU/ M L )的配制 取1 0 0 万单位的硫酸链霉素1 瓶， 注入1 0 m L灭菌水，混匀，吸取8 m L 注入到另 一瓶8 0 万I U的青霉素中，混匀过滤，分装，即配成8 m L 含 t 0 万I U / m L 的青霉素与 链霉素母液，-2 0 0 C贮存，使用时每升培养液加 1 m L双抗母液。 2 . 3 . 2 .3缓冲液的配制 1 . H a n k s 液

45、称取无水C a C 1 2 0 . 1 4 g ,溶解于l O O m L 超纯水中。 维生素A对肉 牛肌内 脂肪沉积及A C C / H S L , P P A R y 基因表达的影响 称取K C l 0 .4 8 , K H 2 P O 4 0 .0 6 8 , M g S 0 4 7 H 2 0 0 .2 8， N a C l 8 g , N a H C 0 3 0 .3 5 g , N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 0 0 . 1 3 4 8 , D葡萄糖1 g ,溶解于3 0 0 m L 超纯水中。 将C a C 1 2 溶液缓慢倒入溶液中，边倒边搅拌混匀。 将混合后的溶液

46、转移至1 L 容量瓶，加超纯水定容至1 0 0 0 m L ,混匀， 过滤， 5 0 0 m L 分装，4 0 C保存。 2 . D - H a n k s 液 称取K C 1 0 .4 g , K H 2 P 0 4 0 . 0 6 g , N a C I 8 . 0 0 g , N a H C 0 3 0 .3 5 g , N a 2 H P 0 4 1 2 H 2 0 0 . 1 3 4 8 ， 超纯水定容至1 0 0 0 m L , 5 0 0 m L 分装，高压灭菌， 4 0 C保存。 3 . H a n k s 平衡盐溶液 H a n k s 液中加0 . 2 m g / m L

47、庆大霉素，I O O U / m L 双抗，过滤除菌，装瓶备用。 2 . 3 . 2 . 4添加因子的配制 1 . 维生素A贮存液 ( 1 m g / m L ) 临用前配制， 分别用2 m L 的乙 醇溶解2 m g 的视黄醇( r e t in o l , R O ) 、 视黄酸( r e t i n o i c a c i d , R A ) 、 棕桐酸 视黄酌 ( r e t i n y l p a l m i t a t e , R P ) ， 分别1 0 0 A L 分 装于P C R 管， 用 铝箔纸包好，一7 0 0 C避光贮存。 2 . 转铁蛋白( t r a n s f e

48、 r i n ) 贮存液1 0 m g / m L 转铁蛋白5 0 m g , 溶于5 m L H a n k s 液， 浓度为1 0 m g / m L ， 过滤除菌， 分装， - 2 0 0 C 贮存。 使用时每升培养液加1 m L 贮存液， 转铁蛋白 终浓度为1 0 闻m L o 3 . 生物素 ( b i o t i n ) 贮存液0 .2 m g / m L 生 物紊2 0 m g ， 用检菌后D M E M / F 1 2 培养基溶解定容至1 0 0 M L , 浓度为0 .2 m 创 m L , 过滤除菌， 分 装，- 2 0 0 C 贮存。 使用时 每升培养液加2 1 m l

49、, 贮存液， 终浓度为1 7 g M o 4 . 泛酸 钙盐( D L - p a n t o t h e n i c a c i d h e m i c a l c i u m s a l t ) 贮存 液0 . 1 m o l / L 将1 . 1 9 1 5 g 泛酸 钙盐溶于适量灭菌 水中， 定 容至5 0 m L ， 浓 度为0 . 1 m o l / L ， 过滤除 菌， 分装， - 2 0 0 C 贮存。 使用时每升培养液加1 m L 贮存液， 泛酸钙盐终浓度为l 0 0 g mo 5 . 牛胰岛素 ( i n s u l in ) 贮存液2 .5 m g / m L 量 取浓H C 1 8 3 .3 3 匹， 定 容至1 0 0 m L ， 浓度为0 .0 1 m o l / L ， 备 用0 牛 胰岛 素5 0 m g , 溶于2 0 m L O .O l m o l / L H C I , 浓度为2 .5 m g / m L ， 过滤除 菌，1 5 m L 离心管分装， - 2 0 0 C 贮存。 使用时每升 培养液加4 m L 贮 存液， 牛 胰岛 素终 浓度1 0 j g / m L .