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1、细菌内毒素检测方法验证方案 起 草 人 起草日期 审 核 人 审核日期 批 准 人 批准日期 厦 门 市 鲎 试 剂 实 验 厂 有 限 公 司 细菌内毒素检测方法验证方案 目的-1 范围-1 责任人 -1 内容-1 1. 实验材料及用具 -1 2 实验准备 -1 3.具体验证步骤 -2 3.1. 鲎试剂灵敏度复核 -2 3.2干扰实验 -4 3.3.供试品细菌内毒素检查 -6 4.验证结论 -8 附： 表1.鲎试剂灵敏度复核记录 表2. 干扰试验记录 表3.细菌内毒素检查记录 细菌内毒素检测方法验证方案 目的： 为确保复方氨基酸注射液 (18AA-)细菌内毒素检测方法的专 属性、灵敏度，保证
2、检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。 范围：复方氨基酸注射液 (18AA-)细菌内毒素检测方法 责任人： 细菌内毒素检验员、 QC 主管 内容： 1. 实验材料及用具 1.1. 电子天平 1.2. 电热干燥箱 1.3. 恒温水浴箱 1.4.水银温度计 1.5. 旋涡混合器 1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 1.7.细菌内毒素工作标准品 1.8.细菌内毒素检查用水 1.9. 实验用具 :移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、 时钟、 75%酒精棉、剪刀、砂轮。 2 实验准备 2.1. 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或 清洗液中充分浸泡， 然后取出
3、将洗液空干， 用自来水将残留洗液彻底 洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容 器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。 2.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后， 将烤箱调至 250，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至 少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。 在不打开金属容器的情况下， 可在两天内使用； 如果玻璃器皿用锡箔 纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤 除去可能存在的外源性内毒素。 3.具体验证步骤 3.1. 鲎试剂灵敏度复核 3.1.1. 实验操作 3.1.1.1.细菌内毒素
4、标准溶液的制备 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用 砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应 防止玻璃屑落入瓶内。 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容 物，用封口膜将瓶口封严， 置旋涡混合器上混合 15分钟。然后进行稀 释，制备成 4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2、0.5、0.25 （为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混 合器上混合 30 秒钟。 3.1.1.2.待复核鲎试剂的准备 取规格为 0.1ml/ 支的鲎试剂 18支，轻弹瓶壁， 使粉末落入瓶底， 用砂 轮在瓶颈轻轻划痕， 75%酒精棉球擦拭后启
5、开备用，防止玻璃屑落入 瓶内。每支加入 0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分 溶解，避免产生气泡。 3.1.1.3.加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列， 其中4列4支（管）， 1列2支（管）。4 支（管） 4 列每列每支分别加 入0.1ml 的2、0.5、和0.25 的内毒素标准溶液；另 2支（管）加入 0.1ml检查用水。 3.1.1.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产 生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器中，试管架保 持水平状态，保温 602 分钟。 3.1.1.5. 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，
6、避免振动， 将每管拿出 缓缓倒转 180观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑 脱者为阳性，记录为（ +）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管 壁滑脱者为阴性，记录为（） 3.1.2. 实验结果计算 如最大浓度 2.0, 4管均为阳性， 最低浓度 0.25, 4管均为阴性， 阴性 对照为阴性时实验为有效， 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即 为鲎试剂灵敏度的复核结果（c）。 c = lg-1 ( X/4) 式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的 内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 3.1.3结果判断 3.1.3.1.判断标准 当c在0.5 2（包括 0
7、.5和2）时判定该批鲎试剂灵敏度复 核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以（标示灵 敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。 3.1.3.2.判断结果：（记录附后） 3.2干扰实验 3.2.1. 操作方法 3.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的 反应有无干扰作用。 使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过 所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 3.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液 取1支细菌内毒素标准品， 用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标 准溶液即 2、0.5、0.25（方法同 3.1.1.1.）。 3.2.2.3.制备含内毒素的供试品溶液 将供试品稀
8、释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释 液将3.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即 2、 、 0.5 、0.25的含内毒素的供试品溶液。 3.2.2.4.鲎试剂的准备 取规格为 0.1ml/支的鲎试剂 36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在 瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用， 防止玻璃屑落入瓶内。 每支加入 0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解， 避免产生气泡。 3.2.2.5.加样 将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4 支（管）， 1列2支（管）。其中的 4支4列每列每支分别加入 0.1ml的 2.0、1.0 、
9、0.5、0.25的内毒素标准溶液，另一列2支（管） 加入0.1ml检查用水作为阴性对照。 将另外 18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管）， 1 列2支（管）。其中的 4支4列每列每支分别加入 0.1ml的含2.0、1.0 、0.5、0.25的内毒素的供试品溶液， 另一列 2支（管）加入0.1ml 供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振 动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入371水浴或适宜恒温器 中，保温 602分钟后，观察并记录结果。 3.2.3.实验结果计算 如两组最大浓度 2.0均为阳性，最低浓度 0.25均为阴性，阴性对照 , 管均为阴性时，按下式
10、计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应 终点浓度的几何平均值 (Es)和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素 溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et). Es= lg -1 ( X s/4) Et= lg -1 ( X t/4) Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的 反应终点浓度的对数值（lg）。 3.2.4.结果判断 3.2.4.1.判断标准 当Es在0.5 2.0 （包括0.5 和2.0） 时，且Et在0.5 Es2.0Es （包括 0.5 E s和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可 在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当Et不在0.5 Es
11、2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品 在该浓度下干扰实验。 3.2.4.2.判断结果：（记录附后） 。 3.3.供试品细菌内毒素检查 在细菌内毒素检查中， 每批供试品必须做 2支供试品管和 2支供试品阳 性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和 2支阴性对照。 3.3.1.操作方法 3.3.1.1.供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过MVD ） 3.3.1.2. 阳性对照溶液的制备 用检查用水将内毒素标准品稀释制成2浓度的内毒素标准溶液（方 法同3.1.1.1.）。 3.3.1.3.供试品阳性对照溶液的制备 用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2浓 度的内毒素
12、溶液。（方法同3.2.1.3.2. 供试品阳性对照溶液的制备）。 3.3.1.4.阴性对照液用细菌内毒素检查用水 3.3.1.5.鲎试剂的准备 取规格为 0.1ml/支的鲎试剂 8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底， 用砂轮在 瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用， 防止玻璃屑落入瓶内。 每支加入 0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解， 避免产生气泡。 3.3.1.6.加样取 8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入 0.1ml供试品 溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD ）作为供试品管， 2支加 入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入 0.1ml检查用 水
13、作为阴性对照管（ NC），2支加入 0.1ml供试品阳性对照溶液作为 供试品阳性对照管（ PPC）。 3.3.1.7.将试管中溶液轻轻混匀后， 用封口膜封闭管口， 垂直放入 37 1水浴或适宜恒温器中， 保温602分钟。保温和取放试管过程应 避免受到振动造成假阴性结果。 3.3.2. 结果判断 3.3.2.1.判断标准 当阳性对照都为阳性、 供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性 时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如 供试品 2 管均为阳性，应认为不符合规定； 如2 管中1管为阳性，1 管 为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试， 4管中如有 1管为阳性， 即认为不符
14、合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD 而 结果出现 2 管均为阳性或 2管中1管为阳性时， 按同样方法复试， 复试 时要求将其稀释至 MVD 。 3.3.2.2.判断结果：（记录附后） 4. 验证结论 附：表 1 鲎试剂灵敏度复核记录 检验目的检验日期 检验依据室温 试剂名称生产单位批号灵敏度 /效价规格 鲎试剂EU/ml 细菌内毒素标准品 EU/支 细菌内毒素检查用水 实验操作 标准品稀释： 反应结果保温时间（60min） 内毒素浓度 EU/ml 2 0.5 0.25 ( ) ( ) ( ) ( ) 阴性对照终点浓度 结果计算结果判断 检验人员校对人员 表 2 干扰试验记录 检品
15、名称检验日期 生产单位室温 供样单位规格 批号包装 检验依据内毒素限度 试剂名称生产单位批号灵敏度 /效价规格 鲎试剂 EU/ml 细菌内毒素标准品EU/支 细菌内毒素检查用水 实验操作 1.标准品稀释： 2. 供试品制备： 3. 含供试品内毒素溶液的制备： 反应结果保温时间（60min ） 内毒素浓度 EU/ml 2 0.5 0.25 ( ) ( ) ( ) ( ) 阴性对照终点浓度 重 1 标准 复 2 对照 管 3 数 4 重 1 含供试品 复 2 的内毒素 管 3 溶液 数 4 结果计算结果判定 检验人员校对人员 表 3 细菌内毒素检查记录 检品名称检验日期 生产单位室温 供样单位规格 批号包装 检验依据内毒素限度 试剂名称生产单位批号灵敏度 /效价规格 鲎试剂EU/ml 细菌内毒素标准品EU/支 细菌内毒素检查用水 实验操作 1.标准品稀释： 2. 供试品制备： 3.供试品阳性对照液的制备： 仪器：保温时间（）保温温度： 结果供试品管供试品阳性对照阳性对照阴性对照 结果判断 检验人员校对人员