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1、! 望童塑量些堂叁生塑趔星堂坌会第九次学术研讨会 4 6 3 选用上，可能有保护性能更好的试剂，如海藻糖、卵清蛋白、牛血清白蛋白等，选用它们可增加试验成功几率， 但其价格昂贵，难于应用在生产上。合适的生产成本，是我们选择试剂和配方的一个原则。 4 3 冻干曲线的制定对于冻干过程和冻干后保护剂能否起到相应保护作用也很重要，选择了好的保护剂材 料并组成合理的配方后，必须制定与配方及保护对象相适应的冻干曲线。由于条件有限，本试验我们仍按常 规保护剂的冻干曲线进行冻干，这显然不尽合理。因此必须经过试验制定一条合理的冻干曲线进行冻干，才 能更好地发挥耐热保护剂的保护功能。 4 4 冻干保护剂的灭菌或除菌
2、方法也是一个值得探讨的问题。高温高压灭菌可杀灭保护剂中的微生物，但也 易引发各种试剂发生物理的和化学的变化而破坏或降低其保护功能；过滤法( 使用除菌滤板或滤膜) 除菌，只 能将细菌滤去；而且当液体黏度过大时，过滤很难进行；一些大分子物质( 如蛋白质) 也可能因此造成部份损 失。我们目前仍采取高温灭菌的方式，如何控制灭菌温度和时间，使之适合大生产上应用，是一个不容忽视的 问题，仍须探讨。 参考资料 1 兽用生物制品学王明俊等主编中国农业出版社1 9 9 7 73 4 53 4 6 2 冷冻十燥技术赵鹤皋林修诚华中理工大学出版社1 9 9 0 51 7 4 17 5 猪巴氏杆菌活疫苗( E 0 6
3、 3 0 株) 生产工艺改革试验 吴国胜，林旭野 ( 广东省生物药厂，广州5 1 0 6 3 0 猪巴氏杆菌活疫苗( E 0 6 3 0 株) 是预防猪B 型肺炎的弱毒活疫苗。由于该种细菌比较脆弱，多年来该疫 苗质量不稳定。主要问题是培养菌数不够高，另一个问题是培养结束后在冷库静置期间及冻干过程活菌死亡 率高达3 0 以上，严重影响疫苗效果。提高菌数、降低死亡率并使之保持稳定是提高产品质量的关键。自 19 9 7 年起，我们对该菌生产流程的各个生产环节进行反复实验、逐步摸清适合该菌苗生产的条件，并在生产 个别环节采用了新的工艺，取得较好效果。实验方法如下： 1 材料与方法 1 1 材料E 0
4、6 3 0 活疫苗生产菌种由农业部成都药械厂提供；生产及检验用的各种培养基由本厂提供。 1 2方法 1 2 1 不同的培养方式对细菌死亡率的影响( 1 ) 按照中华人民共和国兽用生物制品制造规程( 以下简称 规程) 的要求和方法培养选育一级种子备用；( 2 ) 将同量的一级种子分别接种三组个装4 0 0 0 毫升巴氏杆菌 培养基的2 万毫升瓶中，分别进行静置培养、通气培养和振荡培养，其中静置培养为我厂正常生产所采用，培 养时间为2 2 小时，期间从第4 小时开始每2 小时人工摇瓶一次；振荡培养用机械摇床摇动培养，和水浴通气 朋友一样时间都是12 小时；( 3 ) 各组培养结束后取样十倍稀释法活
5、菌计数并做纯粹检验，加明胶蔗糖稳定剂 ( 以下简称稳定剂) 配苗分装，冻干后再取样数菌，并计算活菌死亡率。 1 2 2 二级种子菌数对菌苗效价及菌苗冻干死亡率的影响试验( 1 ) 把要接人发酵罐的同等体积( 都为 4 0 0 0 r n l ) 的二级种子按活菌数分成二组，第一组菌数为8 亿一2 0 亿毫升，按1 2 小时的常规时间培养；第二 组活菌数为6 0 亿8 0 亿毫升，这一组接种后的培养时间为1 11 1 5 小时；( 2 ) 各批次培养结束后取样做 纯粹检验、活菌计数( C F U ) 。菌液加稳定剂配苗分装，冻干后再取样活菌计数，并计算细菌死亡率。 1 2 3 细菌培养结束后静置
6、冷库期间死亡情况试验( 1 ) 按常规的通气培养方法培养巴氏杆菌活疫苗，结束 时取样数菌；( 2 ) 将菌液加稳定剂置2 8 冷库中2 4 小时后再取样数菌；( 3 ) 计算此期间的细菌死亡率。 464Proceedings o f9 t hSymposiumo fBiologicals B r a n c h , C A A V S 1 2 4 不同的冻干过程对活疫苗冻干死亡率的影响试验( 1 ) 用常规方法培养批菌苗，培养结束时取样做 活菌计数；( 2 ) 将菌液加稳定剂配苗分装，立即按不同的冻干曲线分别进行冻于( 搭冻) ，在预冻干后随机取样 数菌，计算冻干前期细菌的死亡率；( 3 )
7、冻干全过程完成后随机取样数菌，计算冻干全过程细菌的死亡率。 2 试验结果 2 1 不同的培养方式对细菌死亡率的影响试验结果见表1 。 表1 不同培养方式对细菌死亡率的影响 批号培养时间种子菌数( 亿m 1 ) 培养菌数( 亿m D干后菌数( 亿m 1 )死亡率( ) 0 0 0 61 2i 6 5 1 2 1 55 2 75 6 3 0 0 0 71 29 5 1 0 0 07 6 32 3 7 0 0 0 81 29 57 8 0 4 1 74 6 6 0 0 0 9121 8 09 2 0 7 0 02 4 0 0 0 0 1 01 21 9 51 3 8 59 2 73 3 1 0 1
8、0 11 16 609 5 0 7 9 01 6 9 0 】0 21 16 6 01 2 039 072 3 2 0 1 0 51 157 2 51 4 4 51 2 4 31 4 0 0 1 0 71 1 56 8 5 8 8 07 7 08 4 0 1 0 81 16 8 59 1 38 9 31 9 2 4不同的冻干过程对活疫苗冻干死亡率的影响试验结果见表4 。 3 小结与讨论 3 1 从不同的培养方式对细菌死亡率的影响试验结果可以看出：( 1 ) 采用静止培养或通气培养时，冻于死亡 率远高于振荡培养，这可能与此同时该菌是兼性厌氧菌有关，静置培养不能保证充足的氧气供应，使细菌发 育不照，
9、菌数上不去；通气培养的通气量较难控制在适当的范围，在通气培养十- - - 4 时后，细菌繁殖已过高峰 史垦童垫量匡芏叁生塑型旦主坌盒塑九次学术研讨会 4 6 5 期，细菌衰老，容易死亡。振荡培养则能提供适量的氧气，在第十二小时培养结束时，细菌繁殖刚好到达高峰 期，生命力旺盛，冻干死亡率因而较低；( 2 ) 二级种子的培养作为本活疫苗生产_ _ 艺流程的一个重要环节，其 中细菌活力的旺盛与否在接下来的大缸培养中有着举足轻重的作用，因此，二级种子宜采用振荡培养的方 法。 表4 冻干过程对疫苗活菌数的影响 3 2 从表2 可以看出，在接种量相同的情况下，二级种子菌数高低对菌苗培养结束时的菌数的影响并
10、不明 显，但二级种子菌数高( 6 0 8 0 亿毫升) 的批次，其冻干死亡率远低于二级种子菌数低( 82 0 亿毫升) 的批 次，起原因可能在于：二级种子菌数低时，细菌通过裂解增殖达到稳定期的代数和所需时间长，细菌菌龄相对 老化，其生命力就趋弱；二级种子菌数高，细菌繁殖快，达到稳定期所需时间短，细菌菌龄相对较低，其活力旺 盛，抵抗力就强。所以，适当提高上缸菌数、缩短培养时间是提高菌苗质量的有效手段。 3 3 从细菌培养后静置期间死亡情况试验看到，菌苗在冻干前静置2 4 小时期间的死亡率在2 03 2 之 间，这是一种巨大的浪费，培养结束后立即配苗分装，是减少这种浪费的有效手段，虽然这样做未能看
11、到冻干 前的纯粹检验结果，不能确定菌液是否污染，活菌计数结果也还没能出来，因此不能确定每瓶的分装量。但是 只要在生产过程中，严格控制污染率，这种措施还是可行的。从这几年的生产情况统计来看，提前分装造成的 损失( 因菌少或污染) ，要大大低于静置2 4 小时造成的死亡损失。所以，提前冻于是可行的。 3 4 从表4 可以看到：( 1 ) 在冻干过程中，菌苗在预冻干后取出数菌，结果跟结束样的菌数比较，发现在此过 程中菌数无明显的变化，这说明该苗的冻干损失主要发生在冻干过程的后半部分；( 2 ) 按照不同的冻干曲线 冻干菌苗，其冻干死亡率大相径庭，冻干曲线：) 的冻干死亡率最低( 平均值为1 4 )
12、，而其它几条曲线的冻干 死亡率均超过3 0 。所以，原来的猪肺疫活疫苗冻干曲线以不适应现在的情况，确定最合适的冻干曲线至关 重要； 根据以二的试验结果，我们对猪巴氏杆菌活疫苗的生产工艺进行如下调整：改二级种子的静置培养为振荡培 养；提高上缸菌数，培养时间相应地略为缩短0 51 小时；培养结束立即配苗分装；冻干过程按照全新的冻 干曲线进行。这些工艺改革大降低了细菌死亡率。另外，结合其它增菌措施，是培养菌数有了较大的提高。正 是在此基础上，我厂生产的猪巴氏杆菌活疫苗的质量有了很大的提高。 自从采用改革后的工艺流程，我们已经累计成功生产了几十批猪巴氏杆菌活疫苗。据统计，平均每批疫 苗效价比工艺改革前
13、提高了8 0 左右。0 0 1 6 、0 0 1 6 两批疫苗的生产情况，正是这种工艺改革成功程度的集中 体现。这两批疫苗二级种子用振荡方式培养，上缸菌数分别为8 1 亿毫升、5 8 亿毫升，接种量均为4 0 0 0 毫 升，培养结束后菌数分别为1 1 0 亿毫升、1 4 0 亿毫升，冻干后菌数分别为9 1 亿毫升、12 0 亿毫升，死亡率 分别为1 7 、1 4 ，达到理想的效果。过去每缸疫苗的产量一般在9 0 万1 8 0 万头份之间，这两批的产量分 别达到3 2 0 万头份、3 8 0 万头份，是以前批产量的24 倍。 自从采用新工艺至今，我厂已经累计生产了大量的猪巴氏杆菌活疫苗。全部产品经本厂监察室成品检 验，全部符合规程中对猪巴氏杆菌( E 0 6 3 0 株) 活疫苗的要求；在用户的使用过程中也没有发现质量问题。 新的工艺切实可行的，取得的经济效益是很明显的。正是在此基础上，该活疫苗实现了从大瓶( 2 0 m 1 ) 到小瓶 ( 7 n d ) 的包装改革，节约生产成本，大幅度提高了经济效益。