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1、食品酶学综合性实验实验1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定【目的和要求】1. 了解酶分离纯化的一般程序；2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法；3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。【实验原理】1. 建立有效的酶纯化程序应考虑的原则（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）要使每步过程的分辨能力呈递增趋势；（8）
2、每步纯化过程后，通过量体积，酶活力和蛋白质浓度测定，监测纯化的进程。2. 菠萝蛋白酶简介菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW，
3、等电点 9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是5565。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。3. 菠萝蛋白酶的粗分离（1）盐析分离盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉淀出来，这种现象即为盐析。利用盐析作用可使
4、不同蛋白质从溶液中析出从而实现分离。这是因为蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使得不同分子量的蛋白质分别析出。用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等。由于硫酸铵的溶解度大而温度系数小（在25时，溶解度为767g/L；在0时，溶解度为697g/L），分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉易得，以硫酸铵最为常用
5、。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，调节盐浓度可适当地将不同的蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在50%饱和度硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白100%饱和硫酸铵中沉淀。硫酸铵的饱和度可从附录的“硫酸铵饱和度计算表”中查找，计算所需添加的硫酸铵量。（2） 透析和超滤 透析和超滤是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲溶液中进行。透析时，需不断更换透析外液，直到透析袋内小分子物质降低至内外平衡为止。超滤是利用压力或离心力，借助超滤膜将不同分子质量物质分离的技术。超滤膜是由丙烯晴、醋酸纤维、硝酸纤
6、维、尼龙等高分子聚合物制成的多空薄膜，截留的颗粒直径为220nm，相当于相对分子质量1 0005105.超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化，还可以达到浓缩的目的。 4. 菠萝蛋白酶活性测定酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区280nm处有最大吸收，且光吸收值与含量成正比，符合Beer定律。根据测定的280nm处的吸收值，可判定菠萝蛋白酶的酶活性。【实验仪器和用品】1. 实验仪器 电子天平、恒温水浴锅、电磁搅拌器、酸度计、可见紫外分光光度计（配石英比色杯和玻璃比色杯）、冰箱、高速离心机、台式天平（离心平衡用）。2. 实验用品（1） 以组为单位的用品 大试管18mm200 m
7、m（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL1，100mL2， 200mL1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL1，1mL2，0.1mL1，0.2 mL1）、漏斗（3个）、量筒 （100mL1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。（2）全班共用的用品试剂瓶（1000mL7，250mL3，60mL20）、烧杯（1000mL4）、塑料烧杯（2000mL2）、量筒 （500mL2，1000mL2）、广泛pH试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量8 00014 000）。【实验材料及试剂】1. 实验材料 新鲜菠萝（3个）。2.试剂配制（1）盐析
8、粗提液 0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL）：称取65.166g Na2HPO4 2H2O（或131.108g Na2HPO412 H2O）5.305g NaH2PO4 2H2O，加蒸馏水溶解，定容至4000mL。 0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS）（配4 000mL）：称取6.517g Na2HPO4 2H2O（或13.111g Na2HPO412 H2O）0.531g NaH2PO4 2H2O，加蒸馏水溶解，定容至4000mL。（2）酶活力测定试剂1酪蛋白（进口分装）（配100mL）:称1g酪蛋白，溶于100ml0.1mol/L
9、PBS（PH7.8），于40-50oC水浴溶解，不停搅拌，约需1-2 h才能完全溶解。激活剂含20mmo1L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)：用0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制，配制100mL，现配现用。10三氯乙酸(TCA)：称20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至200mL。（3）透析袋的处理 新买的透析袋，裁剪成所需大小，在蒸馏水中煮沸30min，取出用蒸馏水漂洗干净，即可使用。【实验步骤】1. 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH
10、7.8 PBS，持续搅拌1015min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。2. 盐析 根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4C 4000rpm离心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS约15mL至完全溶解，测定
11、其体积、蛋白质含量和酶活性。3.透析 将溶解液装入2.5 cm8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于 500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水34次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加23滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42- 未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。4酶活力测定方法取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活剂，加入37预热的1%酪蛋白溶液1mL，准
12、确反应10min，加入10%三氯乙酸3mL反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）。实验步骤按照表格中完成。试剂(ml)对照组平行样品1平行样品2平行样品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活剂0.90.90.90.9酪蛋白111137C准确反应10minTCA333A280nm OD值5.蛋白质含量测定方法将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照
13、附录1）。【结果计算】1.蛋白质含量计算 参照附录1。2.酶活力计算最后酶活结果取3次重复实验的平均值。 A280nm0.0010.1酶液活力（U/mL）= 稀释倍数3.酶比活的计算酶比活（U/mg 蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量4.酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）100= （纯化酶活力纯化酶液体积）/（粗酶活力粗酶体积）1005.酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力6.分析及讨论将测定的数据整理计算分别填入下表，并菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。 菠萝蛋白酶分离纯化表步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg 蛋白
14、）回收率（%）纯化倍数粗提取盐析透析【注意事项】1.酶活性测定时的反应时间一定要准确，并严格控制好反应时的温度。2.高速离心前一定要平衡好离心管。3.注意透析袋是否破裂，透析时间长时要置于4下进行。【思考题】1. 如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。2.常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白质; U/g干重或鲜重；U/g 酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？3. 蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些变性了？哪些没有变性？ 4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%30%饱和度？【参考书目】1.李建武，萧能，余瑞元等，生物化学实验原理和方法，北京，北京大学出版社，1994
15、2.余冰宾生物化学实验指导北京：清华大学出版社，20033.赵亚华，高向阳生物化学与分子生物学实验技术教程北京：高等教育出版社，2005附录1 实验 考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白质含量【目的和要求】掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（01000g/mL），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在
16、2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量。大量的去污剂对测定有严重的干扰，少量可通过对照消除。由于此法简便迅速、干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。【实验器材】分光光度计、离心机、分析天平（万分之一）、药物天平、研钵、烧杯、量筒（10mL1）、容量瓶（100mL1）、刻度吸管（lmL1，0.lmL1）、具塞刻度试管（10mL1）、漏斗、漏斗架、剪刀。【实验材料及试剂】（1）样品溶液。（2）标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000g/mL的原液。（3）染液：称取0.1
17、g考马斯亮蓝G250溶于50mL90乙醇溶液中，再加入100mL 85的磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置一个月。【实验步骤】1.标准曲线的绘制 (1) 01000g/mL标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。管号1234 5 6 1000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g/mL）01.000. 20. 82000. 40. 64000. 6 0. 8 1.00. 4 0. 2 0 600 800 1000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000g/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5
18、ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000g/mL标准曲线。2.样品的测定准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。【结果计算】由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（g/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。查出的蛋白提取液浓度（g/mL）定容体积(mL)样品蛋白含量(g g鲜重) 样品重量(g)【注意事项】1. 比色应在出现蓝色2min1h内完成。2. 测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇浸泡将比色杯上的蓝色清洗干净。【思考题】1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原
19、理是什么？ 2.比较双缩脲法、Folin-酚法、紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的优缺点。【参考书目】1.Bradford，M.M.，Anal. biochem：1976，248-2542.李建武，萧能，余瑞元等. 生物化学实验原理和方法. 北京：北京大学出版社，1994附录2 硫酸铵饱和度计算表（1） 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25C）硫 酸 铵 终 浓 度， % 饱 和 度10202530333540455055606570758090100硫 酸 铵 初 浓 度， % 饱 和 度每 1L 溶 液 加 固 体 硫 酸 铵 的 g 数*0561141141761962092
20、432773133513904304725165616627671057861181371501832162512883263654064494945926942029597891123155189225262300340382424520619253049619312515819323026730734839048558330193062941271621982352733143564495463312437410714217721425229233342652235316394129164200238278319411506403163971321682052452853754694532
21、6599134171210250339431503366101137176214302392553367103141179264353603469105143227314653470107190275703572153237753611519880771579079* 在25C下，硫酸氨溶液由粗浓度调到终浓度时，每L溶液所加固体硫酸铵的g数（2） 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0C）在 0C 硫 酸 铵 终 浓 度， % 饱 和 度20253035404550556065707580859095100硫 酸 铵 初 浓 度， % 饱 和 度每 100mL 溶 液 加 固 体 硫 酸 铵 的 g
22、数*010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.48.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.22002.75.58.311.314.317.520
23、.724.127.631.234.938.742.746.951.255.72502.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.23002.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.240.244.548.83502.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.34002.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.84502.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.35003.06.09.212.515.919.423.026.830.834.85503.06.19.312.716.119.723.527.331.36003.16.29.512.916.420.123.127.96503.16.39.713.216.820.524.47003.26.59.913.417.120.97503.26.610.113.717.48003.36.710.313.98503.46.810.59003.47.09503.51000* 在0下，硫酸铵溶液由初浓度到终浓度时，每100mL溶液所加固体硫酸铵的g数。12