HGH发酵和纯化工艺要点.pdf

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1、资料项目名称： hGH 原液生产工艺的研究资料 第一部分：发酵工艺研究 重组 hGH 发酵工艺研究分：实验室摇瓶研究及上罐工艺研究。实验室摇瓶 研究的主要目的是通过对rhGH 的一系统列优化表达实验， 为上罐发酵确定了基 本工艺条件；然后该工艺又通过在发酵罐水平（5L）进行了不断地优化与验证， 最终确定了本工程菌稳定的发酵工艺，rhGH 的表达量每升培液可达近2g/L。该 工艺经过连续多批中试规模（5L 体积） ，证实工艺稳定。 1、rhGH 表达工艺的实验室研究 在尽可能与发酵罐条件相近的条件下，用小摇得到一定的实验数据，为后 期中试上罐研究提供一定的数据参考。以500ml 三角烧瓶为主，个

2、别实验自选。 批内 2 次，批间 1 次即可。实验对象均采用经筛选最稳定高表达EB0200901 号 菌种。 1.1 最佳诱导 pH 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于50ml 培养基的 500ml 三角烧瓶中（每个条件有副管）， 培养 24hr 左右， 1%甲醇诱导，诱导阶段的 pH 需按下表调节 (因为是 BMGY ， 所有在 BMMY 培养基中直接调节pH) 。诱导 24hr 取样，测定 OD 及 pH，再加 1%甲醇继续诱 导。共诱导 48hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。 实验编号实验条件 1 pH3.

3、0 2 pH4.0 3 pH5.0 4 pH6.0 5 pH7.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4：Marker( 从上到下分子量为97.4KD 、66.2KD 、43.0KD、31.0KD 、20.1KD 、14.4KD) 1：诱导前摇瓶上清液 2、3、5、6、7：依次为pH37 条件下诱导24hr 摇瓶上清液 (pH1.0/点) 8、 9、10：依次为pH35 条件下诱导48hr 摇瓶上清液 (pH1.0/ 点) 图 1.摇瓶 pH 优化电泳图 结论：由于摇瓶实验采用的培养基于上罐不一样，并且实验中对pH 的控 制不十分精确，故认为HGH 在 pH=4.0 附近时表达较好。

4、1.2 保护剂类型及浓度 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于50ml 低盐培养基 (用氨水调节 pH 为 6.0)的 500ml 三角烧瓶中， 培养 24hr 左右，1%甲醇诱导。按下表添加不同的保护剂，诱导24hr取样，测定 OD 及 pH，共诱导 48hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。 实验编号（副管以 表 示） 实验条件 1 CA 0.5% 2 1% 3 Yeast extract 0.5% 4 1% 5 Peptone 0.5% 6 1% 7 空白对照 8 97kD 66kD 43kD 31kD 20kD

5、 14kD HGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1：诱导前摇瓶上清液；2：空白对照诱导48hr；4：Marker 3、5、6、7：依次为添加Yeast extract 诱导 24hr 和 48hr 摇瓶上清液 (6 和 7 为重复 ) 8、9、10、11：依次为添加CA 诱导 24hr 和 48hr 摇瓶上清液 (10 和 11 为复 ) 12、13、14、15：依次为添加Peptone 诱导 24hr 和 48hr 摇瓶上清液 (14 和 15 为重复 ) 图 2.摇瓶补料优化电泳图 结论：首先，三种保护剂中Yeast extract效果较好， 1

6、%浓度也比 0.5%浓度 好。另外，诱导 48 小时能够提高表达量，可作为上罐发酵指导。 2. rhGH 的发酵罐工艺研究（中试研究） 初步完成中试实验，得到一定的实验数据，为后期中试稳定高表达工艺提 供一定的数据参考，为以后进一步优化中试工艺提供依据。以5L 发酵罐，工作 体积为 3L。实验对象均采用经筛选最稳定高表达的EB0200901号菌种。 2.1 毕赤酵母发酵经典方法初步鉴定 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于 250ml BMGY 的 1L 三角烧瓶中，培养48hr左右，上罐发酵， pH5.0(用氨水调节 )、 温度

7、30、DO35%， 待溶氧上升后以1015转度流加 50% 甘油 300ml，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度 1 开始诱导，逐渐提速，诱 导后每隔 4hr 留样离心 -20冻存，诱导 36hr 结束。样品检测 SDS-PAGE、蛋白 含量。 97kD 66kD 43kD 31kD 20kD 14kD HGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3：Marker( 从上到下分子量为97.4KD、66.2KD 、43.0KD 、31.0KD 、20.1KD、 14.4KD) 1：诱导前发酵上清液 210：依次为不同诱导时间发酵上清液(最长 36hr) 图 3.发酵参数优化前电泳图 结论

8、：通过经典的方法，我们发现HGH 能够有一定的表达，但表达水平 较低，说明此项目的发酵工艺还需要进行不断地摸索，优化发酵工艺路线， 提高 表达水平。 2.2 最佳 pH 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于 3 瓶 250ml BMGY 的 1L 三角烧瓶中， 培养 48hr左右，上罐发 酵，初始 pH5.0，诱导 pH(如下表 )、温度 30、DO35%，待溶氧上升后以 1015 转度流加 50%甘油 300ml，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度 1 开始诱导， 逐渐提速，诱导后每隔4hr 留样离心 -20冻存，诱导48hr

9、结束。样品检测 SDS-PAGE、蛋白含量。 发酵罐编号实验条件 1 pH：3.5 2 pH：4.0 3 pH：4.5 rhGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 1、17： Marker(从上到下分子量为97.4KD 、66.2KD、43.0KD、31.0KD 、20.1KD 、14.4KD) 28：依次为pH 3.5 下 诱导 0、8、16、 24、36、44、48hr 916：依次为 pH 4.0 下 诱导 0、8、 16、24、36、44、48hr 1825：依次为pH 4.5 下 诱导

10、0、8、16、24、36、44、48hr 图 4.发酵 pH 参数优化电泳图 结论：从电泳结果来看，与摇瓶结果有差异的是：最佳诱导pH=3.5。根据 文献资料及经验，可能选用更低的pH(3.0)可能会得到更好的表达水平，下一步 将采用更低的 pH 进行对比。 2.3 诱导最佳 pH 验证 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于 2 瓶 250ml BMGY 的 1L 三角烧瓶中， 培养 48hr左右，上罐发 酵初始 pH5.0，诱导 (如下表 )、温度 30、DO35%，待溶氧上升后以1015转 度流加 50%甘油 300ml，待溶氧

11、再次上升后用100%甲醇以转度 1 开始诱导，逐 渐提速，诱导后每隔4hr 留样离心 -20冻存，诱导48hr 结束。样品检测 SDS-PAGE、蛋白含量。 发酵罐编号实验条件 (诱导前菌湿重) 1 pH3.0 2 pH3.5 HGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1、13：为 marker( 从上到下分子量为97.4KD、66.2KD 、43.0KD、31.0KD 、20.1KD 、14.4KD) 210：依次为pH3.0 下诱导 0、7、12、24、36、40、44、48hr 1120(除 13)：依次为 pH3.5

12、下诱导 0、7、12、24、36、40、44、48hr 图 5.发酵 pH 参数优化电泳图 结论：从电泳结果上来看，诱导pH3.0 表达水平明显好于pH3.5，表明采 用更低的诱导 pH 是完全可行及正确的。另外，由于保护剂及诱导pH 选择所解 决的主要问题都是防止目的蛋白的降解，而我们仅通过改变诱导pH 就达到了较 高的表达水平， 完全满足了工艺要求， 考虑到这点及成本方面的原因，故原先准 备摸索的保护剂实验可不予进行。 2.4 发酵工艺稳定验证： 方法：取单克隆，接种到BMGY 一级种子液中，培养17-20hr；按 1:10 的 比例二级接种于 250ml BMGY 的 1L 三角烧瓶中，

13、培养 48hr左右，上罐发酵初 始 pH5.0，诱导 pH(下表)、温度 30、DO35%，待溶氧上升后以 1015 转度流 加 50%甘油，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度 1 开始诱导，逐渐提速，诱 导后每隔 4hr 留样离心 -20冻存，诱导 48hr 左右结束。样品检测SDS-PAGE、 蛋白含量。 HGH HGH 典型电泳图 1 2 3 4 5 6 7 8 hGH 发酵结果 SDS-PAGE电泳图 1.Marker ( 从上到下分子量为97.4KD、66.2KD 、43.0KD 、31.0KD 、20.1KD 、14.4KD) 2.诱导前38：诱导 848 小时，每隔 8 小时样

14、品 结论： 通过本次实验，基本确定并验证了hGH 的发酵工艺。在此工艺条件下，hGH 的 表达水平稳定，表达量高，最终样品扫描结果显示，目的蛋白的表达量在60% 以上，总量达到3g/L 发酵液，而且没有明显的降解条带，这些都为纯化提供了 极大的方便。因此，可以说目前的发酵工艺是稳定、成熟而且高水平的。 第二部份： rhGH 纯化工艺研究 成熟人生长激素是一种由191 个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，hGH含有两 个分子内二硫键， 4 个半胱氨酸，这两个分子内次级键对于形成正确的球性构象 起了重要作用。其分子量为22kD。 1、纯化实验室研究 1.1 Tube小试： 通过使用 1.5ml tube

15、装载 0.5ml 各种不同层析介质 (Q、DEAE、Heparin、CM、 Phenyl)，使用各种不同pH 、缓冲体系、离子强度，摸索最佳层析初始条件。 介质pH 缓冲体系离子强度 Q、DEAE Phenyl、 CM、 Heparin 4.0 、 5.0 、 6.0、 7.0 、8.0 、9.0 醋酸、柠檬酸、PB、 Tris-HCl 10mM 、40 mM、 50mM 如选择 CM-Serpharose FF(Pharmacia) 做层析介质，把样品的 pH 保持在 rhGH 的等电点之下，实验发现载样量很低，目的蛋白收率很低。使用heparin、phenyl 这两种介质不管在等电点之上还

16、是之下， 都出现载量低，目的蛋白收率低的情况。 如选择 Q-Serpharose FF或 DEAE-Serpharose(Pharmacia) 做层析介质，把样品 的 pH 调至 rhGH 的等电点 5.0 之上，对 rhGH 载样量上有所提高， 目的蛋白回收 率也较高。对比这两种阴离子介质，发现Q 在载量上更有优势。 由于有文献报道 rhGH 在 pH8.0 之上容易产生酰胺化，而在Ph3.0之下时不 利于该蛋白的活性。 选择 Qsepharose FF 做层析介质，在 Ph6.07.5 PB 缓冲 体系下载量高，并且分离效果好。 1.2 1ml预装柱、 10-30ml 填充柱小试 借鉴 t

17、ube 小试结果，进行 1ml 预装柱、10-30ml 填充柱柱小试实验， 进一 步摸索 Q并确定最佳层析条件（缓冲液浓度、流速、上样条件、载量、洗脱条 件） 。使用 1ml 预装柱进行柱层析实验，考察不同pH 、缓冲液下对目的蛋白结 合的影响。结果表明，缓冲体系为10mM PB ,Ph7.5 时蛋白的结合效果最佳 , 采用 0.1MNaCl阶段洗脱可以较好洗下目的蛋白，提高目的蛋白纯度。 031010Q01:1_UV1_280nm 031010Q01:1_UV2_260nm 031010Q01:1_Cond 031010Q01:1_Conc 031010Q01:1_pH 031010Q01:

18、1_Logbook 0 100 200 300 400 mAU 0100200300400500600ml s ylo a d 1d o w n lo a d 1 p 1 lo a d 1 1 d o w n 1 lo a d 2 p 2 p 2 2 d o w n lo a d 3 p 3 p 3 3 d o w n lo a d 4 d o w n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 上样前2 穿透峰4 为 10%B 洗下蛋白， 5 为 10%B 峰尖 通 过 实 验 我 们 选 择 了 最 佳 的 第 一 步 层 析 条 件 ： 介 质 为Q- S

19、erpharose FF 、 缓冲 体 系为 10mM PB，Ph7.5 ， 采用 10 SolutionB阶 段 洗 脱 。 通 过小 试 进 一步 摸 索 了 第 二步 层 析 的 一 些 基本 条 件 ： 介质洗脱条件缓冲体系离子强度 Q 0-100B，10CV PB,Ph7.510mM Phenyl 100B直接洗脱PB ，Ph7.510mM 1M (NH4)2SO4 1 2 3 4 5 6 7 8 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 mAU 0 50100150200250300ml lo ad 1 p 1 p 3 d o w n lo ad 4 d o w n 1 3W

20、aste hGH 小试 Q-sepharose FF柱层析结果1-7 为峰 1 不同部分洗脱， 8 为峰 2 高盐洗脱部分 10%B 20%B 30%B 100%B 1 2 97 kD 66 kD 43 kD 31 kD 20 kD 14 kD 将 第 一 步 层 析 洗 脱 得 到 的 含 目 标 蛋 白 的 样 品 ， 再 进 行 Q-sepharose FF柱 线 形 洗脱 ， 从 色 谱 图和 电 泳 图看 ， 杂 质 和 目标 蛋 白 没 有 明 显的 分 离 效 果 ， 主 要 集 中在 一 个 洗 脱 峰 里 。 但 是将 第 一 步 层 析 洗 脱 得 到的 含 目 标蛋 白

21、的 样 品 经 过phenyl柱 的 分 离 后， 得 到 了 纯 度 为 98 以 上的 目 的 蛋 白 。见 下 图 031016phenyl01:1_UV1_280nm 031016phenyl01:1_UV2_260nm 031016phenyl01:1_Cond 031016phenyl01:1_Conc 031016phenyl01:1_pH 031016phenyl01:1_Flow 031016phenyl01:1_SampleFlow 031016phenyl01:1_Logbook 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 mAU 0 50100150ml lo ad

22、 1 lo ad d o w n lo ad 3 p 3 lo ad 4 p 4 p 5 lo ad 6 d o w n 1 2 3 4 5 6 7 89 10 11 1：protein Marker ；2：上样前；3-6：峰 1；7：峰 2；8：峰 2 峰 3 交叉； 9：峰 3；10：峰 3 峰尖；11：峰 3 后半部分 通 过 以上 小 试 结 果 初步 确 定 了一 些 基 本 条 件：将 3K 超 滤后 的 样 品 进 行 第一 步 层 析 时 ， 选 用 Q-sepharose FF为 层 析介 质 , 10mM PB， Ph7.5 为 上 样 缓 冲 液 ，采 用 10%Solu

23、tionB阶段 洗 脱 目 的 蛋 白 ；在 第 二 步 层 析 时，选 用 phenyl-sepharose FF 为 层 析 介质 , 10mM PB+1M（NH4） 2SO4， Ph7.5 为 上 样缓 冲 液 ， 并 用 10mM PB， Ph7.5 作 为 洗脱 缓 冲 液 ， 经 过 两 步层 析 后 rhGH 的 纯 度达 到 98%以 上 。 1 2 3 rhGH 2.rhGH 纯化中试研究 : 借 鉴 实 验 室 研 究 结 果 ， 进 行 层 析 条 件 的 放 大 及 优 化 ， 初步 确 定 中 试 研 究的 工 艺 hGH中试纯化Q柱 SDS-PAGE 电泳图 1.M

24、arker 4. 10%B 洗脱峰峰尖 2.上样前5-6：洗脱杂峰 3.10%B 洗脱峰 1 2 3 4 5 6 7 8 hGH中试纯化phenyl 柱 SDS-PAGE 电泳图 1.Marker 5.Heparin 洗脱目的蛋白峰 2.上样前6.超滤后 3.上样峰7.8 Q 柱上样峰即样品峰 4.洗脱杂峰 1 2 3 4 5 6 97 kD 66 kD 43 kD 31 kD 20 kD 14 kD 97KD 66KD 43KD 31KD 20KD 14KD rhGH rhGH (i) Q-sepharose FF洗脱目的蛋白峰 20031014Q01:1_pH 20031014Q01:1_Logbook 0 200 400 600 800 mAU 0100200300400500ml lo ad sy d o w n lo ad 1 lo ad 2 p 2 p 2 2 d o w n lo ad 3 p 3 d o w n (i)phenyl 柱洗脱目的蛋白峰