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1、微生物肥料生物安全通用技术准则 （NY 1109-2006） 1 范围 本标准规定了微生物肥料使用菌种安全性分级目录、不同菌种及产品选择毒 理学试验的原则、程序、试验方法和结果评价方法。 本标准适用于中华人民共和国境内生产、销售的微生物肥料。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引 用文件，其随后所有的修改单 （不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡 是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 15193.3-2003 急性毒性试验 GB/T 4789.28
2、-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 半数致死量 median lethal dose,LD50 是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量， 该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克 数、克数或毫升数，即mg/kg 体重、 g/kg 体重或 mL/kg 体重。 4选择毒理学试验的原则 4.1生产用菌种 微生物肥料生产用菌种分为四级管理，其安全分级目录见附录A。未列入附录A 中的 菌种，除根瘤菌和乳杆菌(Lactobacillus ）外，其余均需做毒理学试验。 4.1.1第
3、一级（ A.1）为免作毒理学试验的菌种。 4.1.2 第二级（ A.2）为需做急性毒性试验的菌种。 4.1.3 第三级（ A.3）为需做致病性试验的菌种。 4.1.4 第四级（ A.4）为禁用菌种。 4.2产品 4.2.1 除有机物料腐熟剂以外的固体微生物接种剂类产品均免做毒理学试验。 4.2.2 复合微生物肥料、 生物有机肥和液体剂型微生物接种剂等需做急性毒性试 验。 5 毒理学试验程序 5.1 菌种毒理学试验程序 5.1.1 应提供微生物肥料生产用菌种的鉴定资料，包括属及种的拉丁文学名和中 文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等资料。 5.1.2 根据产品所含菌种的鉴定资料，依据
4、附录A 之规定，确定菌种安全级别、 是否做毒理学试验及毒理学检测项目。 5.1.3 对于需要做毒理学试验的菌种，生产者需提供试验用纯菌种斜面，经复 核确认与该菌种鉴定资料相符且无杂菌污染后，进行毒理学试验。 5.2产品毒理学程序 需对送检产品进行菌种和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。 6 试验方法 6.1 受试物的准备 6.1.1菌种受试物 将试验菌种接种于适宜的培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，用生理 盐水调整菌液浓度至2.0 1082.0 109cfu/mL，该溶液为菌种受试物。 6.1.2产品受试物 固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲 基纤维素
5、、明胶、淀粉等。液体产品不可稀释，直接使用。 6.2急性毒性试验 按 GB 15193.3-2003执行。 6.3致病性试验 致病性试验包括以下项目。 6.3.1急性毒性试验 方法同 5.2。 6.3.2 一次破损皮肤刺激试验 6.3.2.1目的 检测受试物对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。 6.3.2.2实验动物 每次实验至少需要3 只皮肤完好的白色健康家兔或豚鼠。 6.3.2.3操作程序 a)涂受试物前，将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉，去毛范围约 2.5cm 2.5cm，用 75%酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或 注射针头分别在两块皮区内划一个“ ” 形的破损伤口。
6、注意皮肤破损仅达表皮， 不要伤及真皮。 b)将受试物 0.5mL 直接滴于破损皮肤上，或滴于同样大小的2 层4 层纱布 上并敷贴于破损皮肤表面， 然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶 布固定。另一侧去毛破损皮肤作为空白对照（或溶剂对照），敷贴时间为4h。 试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。 c)分别于去除受试物后1h、24h 和 48h 观察皮肤局部反应，并按表1 进行刺 激反应评分。 注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑， 应进行重 复测试。 6.3.2.4评价规定 在各个观察时间点，按照表1 对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分， 并按时间点将 3 只
7、动物的评分相加， 除以动物数， 获得不同时间点的皮肤刺激反 应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺激指数，按表2 评定该受试物对动 物皮肤刺激强度的级别。 表 1 皮肤刺激反应的评分标准 皮肤刺激反应皮肤刺激反应评分 红斑形成： 无0 勉强可见1 明显红斑2 中等严重红斑3 紫红色红斑并有焦痂形成4 水肿形成： 无0 勉强可见1 皮肤隆起，轮廓清楚2 水肿隆起约1mm 3 水肿隆起超过1mm4 表 2 皮肤刺激强度分级 皮肤刺激指数刺激强度级别 0 0.5无刺激性 0.5 2.0轻刺激性 2.0 6.0中等刺激性 6.08.0强刺激性 6.3.3 溶血试验 6.3.3.1目的 检测受试物是否
8、具有溶血特性。 6.3.3.2操作程序 用无菌棉拭子蘸取菌种受试物, 以蛇形线接种于血琼脂平板(按 GB/T4789.28-2003中 4.6规定),置 36 1培养箱中培养 , 24h后观察有无溶血环 产生。同时用已知阳性菌株金黄色葡萄球菌等作为对照。 6.3.3.3试验结果 菌落周围有溶血环的，则溶血试验阳性；否则为阴性。 6.3.4抗菌药物敏感试验 质控菌株可选用大肠杆菌ATCC25922 等标准菌株。 6.3.4.1目的 检测受试物对抗生素的敏感性强度。 6.3.4.2试验用抗生素 可选用头孢哌酮（ CFP）、四环素（ TE）、头孢唑啉（ CZ）、链霉素（ S）、 俐特灵（ FR）、环
9、丙沙星（ CIP）、复方新诺明（ SXT）、氯霉素（ C）、氨苄 青霉素（ AM ）、庆大霉素（ GM）、强力霉素（ DO）、丁胺卡那霉素（ AN）、 甲氟哌酸（ PEF）、氟啶酸（ ENO）、多西环素 (DO)、依诺沙星 (ENO)、阿米卡 星(AN)等中的几种。 6.3.4.3操作程序 a) 用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于营养琼脂平板表面，共涂抹3 次。每涂 抹 1 次，平板应转动 60o ，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿,置室温干燥 5min。 b）用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0 10 82.0 109cfu/mL 质控菌株菌悬液，均匀 涂抹于营养琼脂平板表面，具体方法同上，作为
10、对照试验。 c)以无菌操作取出抗生素纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板 培养基表面，每个平板放4 个纸片。然后将平板置于36 1恒温培养箱中培 养 18h 后观察抗生素纸片周围有无抑菌环，量取并记录其直径（包括纸片直径） 大小，单位 mm。试验应做 3 个平行，取其均值。 d)质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。 6.3.5急性腹腔注射致病性试验 6.3.5.1目的 检测受试物的急性致病性。 6.3.5.2试验动物 清洁级健康成年小鼠，体重1820g。 6.3.5.3操作程序 a）选健康成年小鼠40只,体重 1820g，雌、雄各半，剂量为500mg/kg
11、BW， 按 0.1mL/10gBW 经腹腔注射受试物。 b）于腹腔注射后第3d、7d 分别取存活的实验动物雌、雄各5 只解剖，并做大 体病理学观察。 c)腹腔注射后第 14d将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察。 6.3.5.4结果观察、评价 根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体症、大体病理学观察及病理组 织学检查发现病变的程度进行分级判定（见表3）。 表 3 急性致病性判定标准 级别判定依据 强致病性 动物出现死亡， 死亡动物及24h 以上存活动物在第3d、7d 经解剖肉眼检查 或病理组织学检查即可发现脏器的明显病变。 弱致病性 动物有中毒体症无死亡，动物第14d 经解剖肉眼检查或
12、病理组织学检查可 发现脏器的明显病变。 无致病性 动物无中毒体症无死亡，动物第14d 解剖肉眼检查或病理组织学检查均未 发现脏器的明显病变。 6.3.6 急性眼刺激试验 6.3.6 .1 目的 检测受试物对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。 6.3.6.2 实验动物 3 只家兔，试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。 6.3.6.3 操作程序 a）吸取受试物 0.1mL,滴入家兔一侧眼结膜囊内，另一侧眼以生理盐水作为 正常对照。 b） 滴受试物后，将眼被动闭合 4s,30s 后用生理盐水冲洗。 于滴眼后 1h、 24h、 48h、72h、7d、14d和 21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角
13、膜的损伤与恢复情 况。如果 72h 内未出现刺激反应，或第7d 或第 14d，眼睛刺激反应完全恢复， 即可提前终止试验。必要时，用2% 荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及 虹膜变化。 6.3.6.4 评价规定 按表 4 对家兔眼角膜、 虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每 只动物在三个不同观察时间（24h、48h 和 72h）角膜损害、虹膜损害、结膜充血 和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h 和 72h 评分之和除 以观察数 3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时 间进行评分，按表5 或表 6 眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激
14、强度。 表 4急性眼刺激反应的评分标准 眼损害表现评分 角膜损害： 无溃疡形成或混浊 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 角膜不透明，混浊，虹膜无法辨认 0 1 2 3 4 虹膜损害： 正常 皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍 有反应 出血、肉眼可见破坏，或瞳孔对光无反应 0 1 2 结膜（睑结膜、球结膜）充血： 血管正常 血管充血呈鲜红色 血管充血呈深红色，血管不易分辨 弥漫性充血呈紫红色 0 1 2 3 结膜（睑结膜、球结膜）水肿： 无水肿 轻微水肿（包括瞬膜） 明显水肿，伴有部分眼睑外翻
15、水肿至眼睑近半闭合 水肿至眼睑大半闭合 0 1 2 3 4 表 5眼刺激反应分级标准 级别判定依据 可 逆 性 损 伤 无刺激 性 3 只动物的平均评分：角膜损害21 a 为动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害 =0，结膜充血 =0 或 1，结膜水肿 =0或 1 的时 间。 b 至少有 1 只动物于 21d 尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。 7结果评价 凡毒理学试验结果评价为有毒的产品，不得生产和销售；有毒或致病性试验 结果不符合的菌种 ,均不得作为微生物肥料生产用菌种。 7.1急性毒性试验 根据半数致死量（ LD50）数值 ,判定受试物的毒性分级 , 半数致死量 (LD50)
16、剂 量分级按 GB 15193.3-2003附录 D 执行，凡 LD505000mg/kgBW 的，可通过， 即该菌种可作为生产用菌种或该产品可进行生产、销售。 7.2致病性试验 7.2.1 急性毒性试验 结果判定同 6.1。 7.2.2 一次破损皮肤刺激试验 如结果为无刺激或仅具轻度刺激作用，可通过；否则，应放弃使用。 7.2.3 溶血试验 溶血试验结果为阴性的，可通过；否则，应放弃使用。 7.2.4 抗菌药物敏感试验 受试菌株必须对两种以上的抗生素敏感；否则，应放弃使用。 7.2.5 急性腹腔注射致病性试验 结果为无急性致病性可通过；否则，应放弃使用。 7.2.6 急性眼刺激试验 结果对眼
17、无刺激性或具有轻刺激性的，可通过；否则，应放弃使用。 附录 A （规范性附录） 菌种安全分级目录 A.1第一级：免作毒理学试验的菌种 A.1.1根瘤菌类 Azorhizobium caulinodans茎瘤固氮根瘤菌（田菁（茎瘤）根瘤菌） Bradyrhizobium elkanii埃氏慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Bradyrhizobium japonicum日本慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Bradyrhizobium liaoningense 辽宁慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌） Mesorhizobium huakuii华癸中生根瘤菌（紫云英） Mesorhizobium loti 百脉
18、根中生根瘤菌 Rhizobium etli埃特里根瘤菌（菜豆） Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli豌豆根瘤菌（菜豆生物型） Rhizobium leguminosarum biovar trifolii豌豆根瘤菌（三叶草生物型） Rhizobium leguminosarum biovar viceae 豌豆根瘤菌（蚕豆生物型） Sinorhizobium fredii 费氏中华根瘤菌（快生大豆根瘤菌） Sinorhizobium meliloti苜蓿中华根瘤菌 还包括尚未确定种名的，从一些豆科植物根瘤内分离、纯化、鉴定、回接、筛选后在原 宿主植物结
19、瘤、固氮良好的根瘤菌，如花生、绿豆、沙打旺根瘤菌等。 A.1.2自生及联合固氮微生物类 Azospirillum lipoferum生脂固氮螺菌 Azospirillum brasilense 巴西固氮螺菌 Azotobacter beijgerinckii拜氏固氮菌 Azotobacter chroococcum 褐球（圆褐）固氮菌 Azotobacter vinelandii棕色固氮菌 Azotobacter paspali雀稗固氮菌 Beijerinckia indica 印度贝氏固氮菌 A.1.3光合细菌类 Rhodobacter capsulatus荚膜红细菌 Rhodobacter
20、 sphaeroides 类球红细菌 (球形红杆菌 ) Rhodopseudomonas acidophila 嗜酸红假单胞菌 Rhodopseudomonas gelatinosa 胶质红假单胞菌 Rhodopseudomonas globiformis球形红假单胞菌 Rhodopseudomonas palustris 沼泽红假单胞菌 Rhodopseudomonas rutila血色红假单胞菌 Rhodopseudomonas sulfidophila 嗜硫红假单胞菌 Rhodopseudomonas viridis 绿色红假单胞菌 Rhodospirillum fulvum 黄褐红螺菌
21、 Rhodospirillum rubrum 深红红螺菌 Rhodospirillum salinarium盐场红螺菌 Rubrivivax gelatinosus胶状红环菌（胶状红长命菌） A.1.4分解磷钾化合物细菌类 Bacillus amyloliquefaciens液化淀粉芽孢杆菌 Bacillus laterosporus侧孢芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 地衣芽孢杆菌 Bacillus megaterium巨大芽孢杆菌 Bacillus mucilaginosus胶胨样芽孢杆菌 Bacillus subtilis枯草芽孢杆菌 Bacillus thurin
22、giensis 苏云金芽孢杆菌 Thiobacillus thiooxidans氧化硫硫杆菌 A.1.5促生细菌类 Paenibacillus azotofixans固氮类芽孢杆菌 Paenibacillus polymyxa多粘类芽孢杆菌 A.1.6 酵母菌类 Candida guillermondii 季也蒙假丝酵母 Candida membranaefaciens 膜醭假丝酵母 Candida tropicalis热带假丝酵母 Candida utilis产朊假丝酵母 Endomycopsis fibuliger 扣囊拟内孢霉 Pichia farinosa粉状毕赤酵母 Pichia m
23、embranaefaciens 膜醭毕赤酵母 Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母 Rhodotorula rubra深红酵母 A.1.7放线菌类 Frankia sp.弗兰氏克菌（固氮放线菌） Streptomyces chingyangensis泾阳链霉菌 Streptomyces microflavus 细黄链霉菌 A.1.8 AM真菌类 Glomus mosseae 摩西球囊霉 A.1.9其它 Lactobacillus parabuchner类布氏乳杆菌 Lactobacillus acidophilus嗜酸乳杆菌 Lactobacillus bulgaricus
24、 保加利亚乳杆菌 Lactobacillus casei干酪乳杆菌 Lactobacillus delbruecki 德氏乳杆菌 Lactobacillus lactis乳酸乳杆菌 Lactobacillus plantarum植物乳杆菌 Pediococcus pentosaceus戊糖片球菌 Streptococcus lactis 乳酸链球菌 Streptococcus thermophilus 嗜热链球菌 A.2第二级：需做急性毒性（LD50 ）试验的菌种 Arthrobacter aurescens金黄节杆菌 Aspergillus candidus Link 亮白曲霉 Asperg
25、illus niger 黑曲霉 Aspergillus oryzae米曲霉 Aspergillus penicillioides Speg 帚状曲霉 Aspergillus wentii Wehmer 温特曲霉 Eurotium chevalieri Mangin 谢瓦散囊菌 Bacillus brevis(Brevibacillus brevis) 短芽孢杆菌 Bacillus circulans 环状芽孢杆菌 Bacillus coagulans凝结芽孢杆菌 Bacillus pumilu 短小芽孢杆菌 Bacillus sphaericus球形芽孢杆菌 Brevibacterium sp
26、. 短杆菌 Burkholderia fungorum真菌伯克霍尔德氏菌 Chaetomium cochliodes 螺卷毛壳 Chaetomium trilaterale 三侧毛壳 Clostridium pasteurianum 巴斯德梭菌 Geobacillus stearothermophilus嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus ) Geotrichum candidum 白地霉 Nocardia sp. 诺卡氏菌 Nocardiopsis sp. 拟诺卡氏菌 Paenibacillus macerans 浸麻类芽孢杆菌 Penicilliu
27、m citreonigrum 黄暗青霉 Penicillium citrinum 桔青霉 Penicillium frenguentans常现青霉 Penicillium glabcum 光孢青霉 Pseudomonas fluorescens 荧光假单胞菌 Promicromonospora citrea柠檬原小单胞菌 Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌 Pseudomonas stutzeri施氏假单胞菌 Pseudomonas vesicularis泡囊假单胞菌 Rhizopus oryzae米根霉 Sphingobacterium multivorum多食鞘氨醇杆菌 S
28、porotrichum thermophile 嗜热侧孢霉 Streptomyces albidoflavus微白黄链霉菌 Streptomyces fradiae 弗氏链霉菌 streptomyces griseospiralis灰旋链霉菌 Trichoderma harzianum哈茨木霉 Trichoderma koningii康宁木霉 Trichoderma viride绿色木霉 A.3第三级：需做致病性试验的菌种 Acinetobacter calcoaceticus乙酸钙不动杆菌 Acinetobacter baumannii鲍氏不动杆菌 Alcaligenes denitrifi
29、can s 反硝化产碱菌 Alcaligenes faecalis粪产碱菌 Alcaligenes xylosoxidans木糖氧化产碱菌 Bacillus cereus 蜡样芽孢杆菌 Enterobacter agglomerans成团肠杆菌 Enterobacter cloacae阴沟肠杆菌 Enterobacter gergoviae日勾维肠杆菌 Pseudomonas alcaligenes产碱假单胞菌 Pseudomonas diminuta 缺陷假单胞菌 Proteus sp. 变形菌 A.4第四级：禁用菌种 Erwinia sp. 欧文氏菌 Klebsiella pneumoniae肺炎克雷伯氏菌 Klebsiella oxytoca 产酸克雷伯氏菌 Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞菌