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1、低温胁迫对玉米幼苗抗冷性的影响 班级：生物科学1202 学号： A09120033 姓名：张志强 低温胁迫对玉米幼苗抗冷性的影响 生物科学 1202 A09120033 张志强 摘要: 文章研究了以 25为对照 , 用4的低温 24h后胁迫处理玉米幼苗，以研究玉米幼苗的的冷伤 害和抗冷性。结果表明, 低温对玉米幼苗造成显著伤害, 表现为叶绿素含量减少, 根系活力降低 , 生物膜 的通透性增大，过氧化物酶活性降低等。冷伤害程度与胁迫温度、胁迫时间密切相关。 关键词:玉米幼苗；冷害；低温胁迫；抗冷性；叶绿素含量；根系活力；过氧化物酶活性；电导率 引言 对农业生产来说，各种不良环境是影响产量的最直接
2、、最大的因素，因此，加强植物抗 性生理的研究， 探明植物在不良环境下的生命活动规律，了解植物的适应和逆境伤害机制并 加以人为调控，对于农业高产稳产和保护生态环境具有极其重要的意义。 植物的抗寒性分为抗冷性和抗冻性。许多喜温植物虽然不能抵抗零度以下低温的冰冻伤 害, 但对零度以上低温具有一定的忍耐性, 即具有抗冷性。低温在一定程度上破坏细胞膜, 从而影响膜系统维持的生理功能 1 。研究指出 , 大部分植物在温度介于015之间时一系 列生理功能被破坏 1 ，2 。根据对低温的抗性将植物分为两类: 低温敏感型 , 如玉米 ( 极限温 度 5 )，香蕉 ( 极限温度15) ；低温非敏感型, 这类植物在
3、015之间时受冷害的迹象 不明显。另一方面, 植物对冷胁迫具有忍受力, 表现出许多从而提高低温忍受力, 如可溶性 蛋白、糖及游离氨基酸含量升高, 产生较多的胁迫激素ABA等 3 。不同植物 , 甚至同一植物 低温适应性反应由于原产地不同, 其忍耐低温的能力不同。低温冷害是限制植物分布及农业 生产的重要因素, 也是植物引种必须首先考虑的问题 4 。研究表明 , 植物的低温伤害机理首 先涉及到对膜系统的破坏, 膜脂相变 ,从而影响膜系统维持的生理功能 5 。 黑龙江属高寒地区, 玉米为低温敏感型植物，极限温度为4，是我国北方主要栽培作 物之一，是改善人民生活，出口外贸的重要物质之一，对发展农业、畜
4、牧业具有十分重要的 意义。因此此次研究低温胁迫对玉米的伤害有重大的实际意义。 1材料与方法 1.1 试验材料 本试验所用材料为良玉188和九单 57两种不同品种的玉米种子( 由东北农业大学生命科 学学院研究室供) 。取玉米种子 , 各500粒，用蒸馏水将玉米种子洗净，放入大烧杯室温下在 蒸馏水中。先用75%酒精浸泡 10s后用蒸馏水洗净残余酒精，再用5%次氯酸钙浸泡20min后 用蒸馏水洗净，加蒸馏水没过种子，37恒温暗培养进行催芽。12h后，用蒸馏水洗三次， 洗去种子表面抑制生长的物质。将大烧杯中水倒净，用干净的湿布塞住烧杯口，加盖培养皿 保持水分， 37恒温暗培养，每隔12h左右用蒸馏水清
5、洗一次种子。种子萌发后，用砂土培 养法 6 将玉米种子种植于砂基培养皿中,保证每天光照12h, 室温为 252，生长至 3叶一心 , 供低温处理之用。 1.2 处理方法 将每个品种的供试材料分为两组, 一组于原处继续生长, 另一组移至4冰柜进行低温 胁迫分别处理24h，分别于常温对照和低温处理处取材，测定其生理生化指标。 1.3 生理生化指标的测定及方法 1.3.1叶绿素的定量测定 1. 称取剪碎的新鲜植物叶片0.5 g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2至3ml体 积分数为 95 %的乙醇，研成匀浆，再加入乙醇10 ml，继续研磨至组织变白。静置3至5分钟。 2. 将提取液过滤到25 m
6、l 容量瓶中，用乙醇定容，摇匀。 3. 将提取液倒入1 cm比色杯内。以体积分数为95%的乙醇为空白，在波长665 nm、649 nm 下测定吸光度。 4. 计算 649665AA6.88-13.95AC (mg/L) A7.32-24.96AC 649665B (mg/L) A18.086.63ACCC649665BAT (mg/L) 1000g / g/mg ）（ ）（）（ ）叶绿素含量（ W LVLmgCT 式中 V 提取液体积 W 样品鲜重 1. 3. 2 外渗电导率 1. 称取 0.5g 的叶片组织（对照组与处理组各0.5g ） ，放入洁净小烧杯中。 2. 将处理组置于冷冻层15 分
7、钟后，待室温，用抽气机对两烧杯溶液进行抽气。 3. 将叶片置于小烧杯中摇匀，对照组与处理组均各摇10min。 4. 用电导仪测其初始电导值S1t、S1ck,。 5. 测毕，将小烧杯置于沸水以杀死植物组织，取出试管后冷却至室温，在室温下平衡 10min 后 ,测量终末电导率S2t、S2ck. 6. 计算，将得到的电导率S1、S2代入下面公式中，计算伤害度： 02 01 S-S S-S L 式中 S0为所用蒸馏水电导率 ck ckt L-1 L-L 伤害度100% 式中 L t为实验组伤害度 Lck为对照组伤害度 1.3.3 根系活力测定 1. 标准曲线的制作 2. 分别称取四份根尖样品0.3 g
8、,三组作为实验组和一组对照组放入小烧杯中，加入 0.4 TTC溶液和磷酸缓冲液（pH=7.0）各 5 mL，对照组中加入2 mL H2SO4, 使根充分浸没在 溶液内，在 37下暗保温 12 h ，此后立即实验组中加入1 mol/L 硫酸 2 mL，以停止反应。 3. 再把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯34 mL，充分研磨，以提 出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤23次，皆移入刻度试 管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL，用分光光度计在波长485 nm下比色，以空白试验作参 比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC 还原量。 4. 计算 ）时间（）根
9、种（ ）还原量（ ）还原强度（ hg gTTC hggTTC/ 1.3.4 过氧化物酶活性测定 1. 取 0.3g 叶片组织，放入研钵中，加入适量pH=5.5 的磷酸缓冲液研磨成匀浆，将匀 浆转入离心管中，以4000 rpmin离心 10 min ，用 pH=5.5 的磷酸缓冲液定容至10ml。 2. 实验组中依次加入2.9 ml pH=5.5 的磷酸缓冲液、1.0 ml 2%H 2O2、 1.0 ml 0.05 mol/L 愈创木酚和0.5 ml 酶液，放入 37恒温锅中水浴15 min，生成红色物质， 并加入 2.0 ml 20% 的三氯乙酸以终止反应，然后在470 nm 波长下测定吸光度
10、。 3. 对照组中先加入酶液0.5 ml，需在沸水浴中灭活，其余步骤与实验组相同，在 470nm 波长作为空白组调零，测定实验组的吸光度值。 4. 计算，将得到的吸光度代入下列公式中，计算酶活性： tV0.01W VA s t470 过氧化酶活性 式中 A470 470nm 下的吸光度，以0.01 为一个单位 Vt 酶液总体积 W叶片组织质量 Vs 反应所用酶液体积 t 反应时间 2.结果与分析 2.1低温胁迫后叶绿素含量的变化 表 1：低温胁迫和正常情况下两种品种叶绿素含量测定 品种温度 /波长665nm 649nm 叶绿素含量 （mg/g） 良玉 188 常温0.869 0.360 16.
11、95233 低温0.715 0.302 10.91971 九单 57 常温0.611 0.255 9.22047 低温0.387 0.167 6.03855 通过数据表明低温冷害处理后, 叶绿素的含量显著降低, 经 4分别低温处理24h 后 良玉、九单的幼苗叶绿素含量仅为25正常处理幼苗叶绿素含量的64.4%、65.5%( 表 1, 图 1)。 叶绿素含量（ mg/g） 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 常温低温常温低温 良玉188九单57 叶绿素含量（ mg/g） 图 1：低温胁迫对玉米幼苗叶绿素含量的影响 分析叶绿素含量降低的原因如下: 1) 低温下 SOD 等保护酶的活性
12、、 含量降低 , 无法保护叶绿素不受自由基伤害, 使含量 降低。 2) 植物受低温冷害, 光合系统最先受到攻击, 光合系统的破坏使光合电子传递链相 关产物积累 , 进而对光合系统产生毒害作用, 同时破坏类囊体内的叶绿素 7 。由于低温 , 使 生理代谢过程中产生的某些毒物( 积累毒物 ) 不能及时清除, 这正是受到胁迫的植物叶绿素 含量低的一个原因 4 。 2.2 低温胁迫后相对外渗电导率的变化 根据实验数据 ( 表 2, 图 2) ，外渗电导率（伤害率）随低温胁迫的变化 表 2：两种玉米种子幼苗外渗电导率 品种S0 S1 S2 S1 低温S2 低温Lt LCK 伤害率 良玉 188 2.74
13、 46.5 216.4 184.5 490 0.371 0.240 20.98% 九单 57 4.57 178.1 479 161.05 391.5 0.405 0.158 29.03% 伤害率 0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00% 30.00% 35.00% 良玉188九单57 伤害率 图 2：低温胁迫后伤害率的变化 外渗电导率（伤害率）是反映生物膜通透性的重要参数, 而膜的通透性是生命活力的 指标之一。植物低温冷害中最核心的伤害是膜系统被低温破坏 7 。正常情况下细胞是一个完 整的生物膜系统, 其流动性与膜中磷脂的流动性有直接关系。生物膜中饱和磷脂
14、与不饱和磷 脂交替排列 , 整个系统以液晶状态存在。对低温敏感的植物的膜中含有较多的饱和脂肪酸, 而抗性较强的植物的膜内含有较多的不饱和脂肪酸, 以保证低温状态下膜的流动性。低温冷 害可引起膜相分离, 使不饱和脂肪酸、 饱和脂肪酸各自聚集在一起, 此时细胞膜由流动镶嵌 的液晶状态转变成凝胶状态, 从而使细胞膜的完整性受到破坏。同时膜上吸附有一定生理功 能的离子如Ca 2+ 脱落 , 伴随细胞内部离子外渗, 从而使细胞的外渗电导率增加。外渗电导 率随冷害的加重而升高显示了细胞膜所受的伤害程度随冷害而加重的过程。 2.3 低温胁迫后根系活力的变化 玉米根系不仅是水分和肥料的吸收器官, 而且还具有氨
15、基酸和激素的合成以及转化等 多种功能。从 ( 表4, 图4) 可以看出 , 低温胁迫后 , 两个品种的根系活力出现了不同程度的变 化，这说明低温胁迫会使根受到不同程度的伤害。 表3：两种种子在不同温度下处理后在A485下的吸光值 品种九单 57 良玉 188 TTC 还原强度（g/g h） （九单 57）（良玉 188） 室温0.026 0.026 28.8886 28.8886 低温0.022 0.021 24.4442 23.3331 TTC 还原强度 0 5 10 15 20 25 30 35 九单57 良玉188 T T C 还 原 强 度 （ g / g h ） 室温 低温 图 3：
16、低温胁迫对玉米幼苗根系活力的影响 由 TTC 还原强度的变化可知( 表 3, 图 3) , 脱氢酶的活性因低温冷害的加深有显著的 下降 , 从一个侧面反映出整个根系的活力随低温冷害的加重而降低。分析原因可能是由于脱 氢酶的合成受阻, 分解加剧 , 也不排除部分脱氢酶的构象在低温胁迫下产生了变化或者受 到某种低温积累抑制物的影响而不再具有生理活性。脱氢酶生理活性的降低进一步导致根系 呼吸代谢速率的降低, 由此可间接的反映根系的ATP 供给情况 ,ATP 供给的减少直接影响到 植物对水分和无机盐的吸收。 2.4 低温胁迫后过氧化物酶活性的变化 叶片中过氧化物酶的活性随冷害的加重而降低( 图 4，图
17、 4)。这是由于低温影响了相关 RNA 的转录、翻译 , 以及各种酶的生理活性, 从而使过氧化物酶的合成减少, 同时植物为抵 御低温冷害而水解体内的部分蛋白质, 使游离氨基酸, 特别是脯氨酸增加, 过氧化物酶的 分解加剧 , 从而使其相对含量降低。这将从一定程度上抑制植物体对过氧化物的分解, 由于 过氧化物会对细胞产生一系列破坏( 如不饱和脂肪酸被氧化, 还原性的辅酶因子被氧化, 某 些酶活性 , 细胞信号改变等) , 过氧化物的升高将影响到整个植物体其他生理活动。 图 4：两种不同种子在不同温度下处理过后的 A470/ t 品种温度波长 470 nm 过氧化物酶活性 （mg/g） 良玉 18
18、8 常温1.515 2028.8 低温0.730 1106.2 九单 57 常温1.330 1773.3 低温1.127 1502.6 过氧化物酶活性（ mg/g） 0 500 1000 1500 2000 2500 常温低温常温低温 良玉188九单57 过氧化物酶活性（ mg/g） 图 4: 低温胁迫对玉米幼苗过氧化物酶活性的影响 3.实验讨论 3.1 电导率与抗冷性的关系 生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构, 各种逆境对细胞的影响首先作用 于生物膜 , 低温伤害也是如此。低温胁迫下,质膜的结构和功能受到伤害, 导致细胞膜透性增 大, 电解质外渗 , 电导率增大 , 能够比较客观地
19、反应植物在低温逆境中的伤害状况。本试验通 过对九单和良玉两个品种进行室温与低温胁迫后幼苗的电导率的测定, 从测定结果可知随着 低温胁迫时间的增加，电导率不断增加。 3.2 脯氨酸含量与抗冷性的关系 在低温条件下, 脯氨酸的积累是对低温环境的一种保护反应, 脯氨酸能调节植物细胞膜 的稳定性 ,还具有清除活性氧和稳定细胞结构的作用。冷胁迫下脯氨酸含量迅速增加,可以降 低水势 , 作为防脱水剂来保护植物 5,6 。脯氨酸的积累可能是由于蛋白质合成受阻,也可能是 由于合成受激或氧化受阻, 还可能是蛋白质降解的结果。在本试验中发现, 从低温胁迫后 , 各 品种幼苗的脯氨酸含量一直升高, 这说明了脯氨酸与
20、水稻抗寒性密切相关。在植物受到伤害 时, 脯氨酸可能是通过保护酶的空间结构, 提供足够的自由水及生理活性物质对细胞起保护 作用。 3.3 保护酶活性与抗冷性的关系 生物体通过SOD 、POD和 CAT三者协同作用 , 使自由基维持在一个低水平, 从而防止自由 基伤害 , 使需氧生物得以生存, 故 SOD 、POD和 CAT 三种酶被称为保护酶系统。低温胁迫下, 对保护酶活性的变化前人已作过许多研究, 这方面的报道也较多, 张泽煌 8 、彭昌操 9 、马翠 兰 10 等通过对茄子、柑桔、柚等植物在低温胁迫期间SOD 、POD和 CAT活性研究认为:SOD能 以超氧阳离子为基质进行歧化反应, 从而
21、清除植物组织和细胞内的超氧阳离子自由基, 减缓 氧自由基对细胞膜的损伤; CAT 可以分解H2O2;POD 主要起到酶促降解H2O2的作用 , 解除细胞 内有害自由基。本试验研究了低温处理前后玉米幼苗的POD活性进行测定。结果表明:低温 胁迫后供试品种幼苗的保护酶活性均增加, 保护酶通过共同的增加来抵御逆境产生的伤害, 这与前人的结论一致。 参考文献 1Staffan Erling Tjus,BirgerL indberg Moller. Photosystem I is an Early Target of Photoinhibition in Barley Illuminated at C
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