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1、PRRSV 经典株与 Nsp2 变异株 RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作 规程（检验SOP） 1适用范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）经典毒株与 Nsp2基因缺失株的特异性逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR ）区分技术。 本标准适用于疑似感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪的组织、 血液及其他病料样品。 2. 试剂 2.1 天根公司 TIANamp Virus RNA Kit 病毒 RNA 提取试剂盒，目录号： DP315-R 2.2 赛百盛公司goldview 2.3 天根公司 Quant One Step RT-PCR Kit ，目录号： KR113 2.4 琼脂糖
2、 2.5 分析纯酒精（ 99.7%） 2.6 6 DNA 电泳 Loading Buffer 3实验室条件 3.1 仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外 仪、微量移液器、水浴箱等。 3.2 从事 PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出DNA 提取区、 基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免 对实验室造成污染。 4. 试剂的准备 4.1 扩增 PRRSV 的引物： PRRSV P1、PRRSV P2 、PRRSV LOW。 4.2 1.5%琼脂糖凝胶加入 0.1% goldview 4.3 1 TAE 缓冲液 4.4 goldview 4
3、.5 灭菌超纯水 4.6 DNA 分子量标准（ Marker DL1000） 5. 操作步骤 5.1 样品处理 处理材料： a. 材料为发病猪只血液、血清或淋巴液可直接吸取140L 。 b. 材料为细胞上清液，可直接使用140L 新鲜上清混匀。 c. 材料为贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，反复冻融三次，然 后3000r/min离心5min，取上清液 140L 。 d材料为病猪肺脏、淋巴结、扁桃体等病料样品时，需要先用生理 盐水或PBS进行研磨，收集研磨物后反复冻融 3次， 12 000r/min离心10min， 取上清140L 。 5.2 用移液器将 560L Carrier RNA 工作液
4、（为裂解液 RL与Carrier RNA溶 液的混合液， 配制方法如附录配液表配制） 加入一个干净的 1.5mL离心管 中。 注意：如果样本体积大于140L，可等比例增加工作溶液和无水乙醇的用量。 5.3 向离心管中加入 140L 检测样品（样品需平衡至室温），涡旋振荡15 秒混匀。 注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA 工作液需要彻底混匀。 5.4 在室温（ 15-25）孵育 10分钟。 5.5 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。 5.6 加入560L 无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒。 注意：如果周围环境高于25, 乙醇需要在冰上预冷后再加入。 5.7 简短离心以收集
5、附着在管壁及管盖的液体。 5.8 仔细将离心管中的 630L 液体转移至 RNase-free 吸附柱 CR2 （吸附柱放 在2mL收集管中），盖上管盖， 6000 g（8000rpm）离心1分钟，弃废液， 将吸附柱放回收集管。 注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完 全转移到收集管中，如为组织苗，在过柱前请离心后将上清液过柱。 5.9 重复此步骤 7。 5.10 小心打开吸附柱盖子，加入500L 溶液GD（使用前请先检查是否已 加入无水乙醇），盖上管盖，6000 g（8000rpm）离心 1分钟，弃废液， 将吸附柱放回收集管。 5.11 小心打开吸附
6、柱盖子，加入500L 溶液RW（使用前请先检查是否已 加入无水乙醇），盖上管盖，6000 g （8000rpm）离心 1分钟，弃废液， 将吸附柱放回收集管。 5.12 将吸附柱放回收集管中，13,400 g （12,000rpm）离心3分钟，使吸 附膜完全变干，弃废液。 注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。 5.13 可选步骤：将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放 置3分钟，使吸附膜完全变干。 5.14 将吸附柱放入一个 RNase-free 超净离心管（ 1.5mL）中，小心打开 吸附柱的盖子，向膜中央加入60L RNase-free ddH2O，盖上盖子，室温 放置5分
7、钟。6000 g （8000rpm）离心 1分钟。 5.15 可 选步 骤：将 上一步 骤 的洗脱 液再次 加入膜中 央 ，并 6000 g （8000rpm）离心1分钟，以增强 RNA洗脱效果。 注意： 确保洗脱液 （RNase-free ddH2O ）在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小 （小于 50L），为了将膜上的RNA 充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位置。洗脱体 积可以根据后续的实验要求灵活处理，洗脱液 （RNase-free ddH2O ）加到吸附柱后，离心前在室 温放置 5分钟，有助于提高RNA 的产量。 5.16 将提取的 RNA 样品按照下条件进行RT-PC
8、R，剩余部分请及时放入 -80保存（所有配置工作均在冰上进行） 。检测设阴、阳性对照。 配置如下体系： (25L体系) Rnase-free ddH2O 8.75L 10 RT-PCR buffer 2.5L dNTP Mixture 1.0L 5 RT-PCR enhancer 5.0L Hotmaster Taq polymerase 1.25L Quant Rtase 0.25L Rnase 0.25L 扩增引物 (P1P2LOW) 各 1.0L RNA 模板3.0L PRRSV 检测反应条件： (1) 反转录反应30min 50 (2) PCR预变性4min 94 (3) 变性40s
9、94 (4) 退火40s 5535 Cycles (5) 延伸40s 65 (6) 延伸10min 65 (7) 保温16 5.17 电泳 5.17.1 制备1.5%琼脂糖凝胶板。 5.17.2 取5 L PCR产物与1 L的上样缓冲液 （10 loading buffer）混匀后加 入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 5.17.3 加入分子量标准。 5.17.4 盖好电泳仪，插好电极，90V电压电泳， 1h。 5.17.5 在紫外仪观测下用数码相机照相并进行照片存档。 5.17.6 用分子量标准比较判断 PCR片段大小。 6. 结果判定 每次样品应当设置标准阳性对照（经典毒株与Nsp2缺失毒株）及空
10、 白对照，若待检样品扩增出与经典毒株标准阳性对照大小相同的特异性 条带且空白对照无条带， 即可判为经典毒株感染； 若检测样品扩增出Nsp2 基因缺失株标准阳性对照大小相同的特异性条带且空白对照无条带，即 可判断为 Nsp2基因缺失毒株感染； 未扩增出与标准阳性对照大小相近的 特异性条带，则判为阴性；若空白对照扩增出与标准阳性对照相似的条 带，则该次实验判为失败，应当重新进行一次RT-PCR检测。 图 1 PRRSV 的检测结果 M: Marker DL1000 ；+1 为 CH-1a 株阳性对照， +2 为经典株阳性对照、+3 为变异株阳性对照； 1、 2、 3、 4 为样品编号。 注： 蓝耳
11、变异株扩增目的片段为180bp， 蓝耳经典株扩增目的片段为250bp。 附录: TAE 电泳缓冲液 (50) 1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA)溶液 (pH8.0) 二水乙二铵四乙酸二钠18.61g 灭菌双蒸水80mL 氢氧化钠调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水加至 100mL 2TAE 电泳缓冲液 (50 )配制 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 242g 冰乙酸57.1mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 (pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水加至 1 000mL 3 1%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖1.5g TAE 电泳缓冲液 (1)100mL 微波炉中完全融化，加 g
12、oldview5L 混匀。 4. Carrier RNA 工作液的配制 样品个数 RV(mL) Carrier RNA 水溶液 (L ) 样品个数 RV(mL) Carrier RNA 水溶液 1 0.56 5.6 13 7.28 72.8 2 1.12 11.2 14 7.84 78.4 3 1.68 16.8 15 8.40 84.0 4 2.24 22.4 16 8.96 89.6 5 2.8 28.0 17 9.52 95.2 6 3.36 33.6 18 10.08 100.8 7 3.92 39.2 19 10.64 106.4 8 4.48 44.8 20 11.20 112.0 9 5.04 50.4 21 11.76 117.6