发酵工艺实验讲解.pdf

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1、1 实验一菌种的传代培养 一、实验目的 1 掌握菌种传代培养的原理 2 掌握菌种传代培养的操作过程 二、实验原理 细胞在培养器中长成致密单层后，已基本上饱和， 为使细胞能继续生长并且活化细胞的 代谢性能，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。活化后的菌种经过扩大培 养就会大量繁殖，把菌种通过逐级扩大培养，使其大量繁殖并保留生长更加良好的菌种。传 代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过 程。 三、实验器材 1菌种：金色链霉菌 2培养基（麸皮培养基）：麸皮360 克；磷酸氢二胺30 克；磷酸氢二钾02 克； 硫酸镁01 克；琼脂150 克；蒸馏水1

2、0 升；ph 70 3其它：电子天平；250ml 三角瓶；电炉；灭菌锅；培养皿（5 个） ；试管；无菌操作台； 酒精灯；接种环；涂布棒；报纸；细绳；棉塞；牛皮纸；玻璃棒。 四、实验步骤 使用培养皿培养菌种 1.按上述培养基配方配制250 毫升培养基， 装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，用棉塞 塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2.把培养皿用报纸包好，细绳系牢，以备灭菌。 3.把物品放入灭菌锅中在121下灭菌1520 分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。 4.在无菌条件下，在每只培养皿中分别倒入培养基20ml 左右，放平，冷却后备用。 2 5.待培养基冷却凝固后，在无菌条件下， 选择一个生

3、长良好的菌种，用接种环在平板培养 基上接种，并用涂布棒将菌种均匀涂遍整个培养皿。 6.将接种好的平板做好标号后，将其放入29的培养箱中培养，倒置培养。 使用试管培养菌种 1按上述培养基配方配制250 毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，然后将 其倒入试管用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2 把物品放入灭菌锅中在121下灭菌1520 分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。 3 将灭了菌的试管取出并斜放（保证足够的斜平面），待其冷却凝固。接下来的步骤同培 养皿的培养方法。 注意事项 ： 14 和 5 步均为无菌实验。 2传代培养周期为45 天。 3 实验二发酵种子培养 一、实验

4、目的 掌握发酵种子培养的原理和方法。 二、实验原理 种子扩大培养简称种子扩培是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻 干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大 培养 ,最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯 化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。所以种子扩大培养的任务是为了得到 纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程 来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。抗生素生产中，放线菌 的细胞生长繁殖较慢，常采用二级或三级种子扩大培养；一般 50t

5、发酵罐多采用二级或三 级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产。 种子扩培所得的纯种培养物称为种子。对于种子而言，应当具备以下要求：总量及浓 度能满足要求； 生理状况稳定， 个体与群体区隔明显；活力强， 移种发酵后， 能够迅速生长； 无杂菌污染。 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄的确 定受到诸多因素的影响，如果种龄过短则菌体太少，如果种龄过长，则菌体易老化。 种子扩培的一般过程是： 斜面菌种 一级种子培养（摇瓶） 二级种子培养(种子罐 ) 发酵 对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所 用的设备为培养箱、摇床等实验室常见

6、设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在 工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。并非所有的种子扩 大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特 性、接种量的影响。 种子培养基与发酵培养基的区别：1 种子培养基一般是基础培养基，含有微生物生长繁 殖需要的基本营养物质，微生物生长过程中不需在添加营养素、改变PH 值的外界条件；2 发酵培养基多为营养培养基，添加特殊营养成分，且发酵过程中要调PH 值，温度等外界条 件。 4 三、实验器材 1 菌种：金色

7、链霉菌 2 培养基 （）： 葡萄糖4.2；氯化钠0.2；硫酸胺0.3； 碳酸钙0.4； 硫酸镁0.025； 磷酸二氢钾0.025；ph 6.0。 3 试剂：蒸馏水 4 其它：电子天平；三角瓶（250ml、100ml） ；电炉；棉塞；牛皮纸；细绳；灭菌锅；无 菌操作台；酒精灯；无菌吸管；摇床。 四、实验步骤 1 按上述培养基配方配制50 毫升培养基，装入一只250 毫升三角瓶中，加热使药品溶解 后（保持低温加热） ，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2 用一个 100 毫升的三角瓶装入蒸馏水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 3 把物品放入灭菌锅中在115 时灭菌 15 20

8、 分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。 4 待培养基和无菌水冷却至适宜温度时，在无菌条件下， 将两支斜面的孢子用无菌水制成 悬浮液，用无菌吸管吸1ml 接入摇瓶的培养基中。 5 将摇瓶放置在29 、 160 r/min 的摇床上培养2224 小时。 注意事项 ： 1接种必须在无菌条件下进行。 2 葡萄糖在超过115 的时候就会发生变性，灭菌时必须特别注意，要有人看护。 5 实验三金霉素的发酵 一、实验目的 1 掌握摇瓶发酵的原理 2 掌握摇瓶发酵的操作过程 二、实验原理 1、发酵来源 发酵现象早巳被人们所认识，但了解它的本质却是近200 年来的事。英语中发酵一词 fermentation 是

9、从拉丁语fervere 派生而来的，原意为“ 翻腾 ” ，它描述酵母作用于果汁或麦 芽浸出液时的现象。沸腾现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引 起的。 在生物化学中把酵母的无氧呼吸过程称作发酵。我们现在所指的发酵早已赋予了不 同的含义。 发酵是生命体所进行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据 生命体本身所具有的遗传信息去不断分解合成，以取得能量来维持生命活动的过程。发酵 产物是指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物质。 实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成CO2 和水，而发酵最终是 获得各种不同的代谢产物。因而，

10、现代对发酵的定义应该是：通过微生物 （或动植物细胞） 的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程。 2、发酵的定义 (1)微生物生理学严格定义的“ 发酵 ” ： 有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧化。 微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分为有氧呼吸和无氧呼 吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。 发酵是这样一种生物氧化方式：在没有外源最终电子受体的条件下，化能异养型微生物细 胞对能源有机化合物的氧化与内源的（已经经过该细胞代谢的）有机化合物的还原相耦合， 一般并不发生经包含细胞色素等的电子传递链上的电子传递和电子传递磷酸化，而是通

11、过 底物（激酶的底物）水平磷酸化来获得代谢能ATP；能源有机化合物释放的电子的一级电 6 子载体NAD ，以 NADH的形式直接将电子交给内源的有机电子受体而再生成NAD ，同 时将后者还原成发酵产物（不完全氧化的产物）。 细胞中的NAD 是有限的，如果作为一级电子载体的辅酶NAD 不能得到再生，就不能被 回用，有效的电子载体就会愈来愈少，脱氢反应就不能持续进行下去了。因此辅酶NAD 的再生是生物氧化（包括发酵）继续进行下去的必要条件。 (2) 专业词汇 “ 发酵（ fermentation）” “ 发酵 ” 这个词汇在生活中往往是人联想到发面制作大饼、油条、馒头、包子，或者联想到 食品酸败物

12、品霉烂。 “ 发酵 ” 作为专业词汇其含义不但覆盖发面制作大饼、油条、馒头、包子，更重要的是指用 发酵的手段工业化生产酒及酒精饮料、食品及食品添加剂、饲料及饲料添加剂、药品、化 工材料等等。 (3)工业生产上定义的发酵“ 工业发酵 ” 工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业生产均称为“ 发酵 ” 。这样定 义的发酵就是“ 工业发酵 ” 。工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提 供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式：有氧呼 吸、无氧呼吸和发酵。 近百年来，随着科学技术的进步，发酵技术发生了划时代的变革，已经从利用自然界中原 有的微

13、生物进行发酵生产的阶段进入到，按照人的意愿改造成具有特殊性能的微生物以生 产人类所需要的发酵产品的新阶段。 3、发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下： 1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比 较简单。 2）发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机 氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这 特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 3）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较 为

14、单 的代谢产物。 4）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的 7 化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 5）发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过 滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失， 要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 6）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株 并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。 7）工业发酵与其他工业相比，

15、投资少，见效快，开可以取得显著的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程 除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶， 也可以用人工构建的“ 工程菌 来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种 各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和 创新。 4、发酵的类型 根据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成若干类型： 1）按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。 2）按发酵产物来区分：如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发 酵等

16、。 3）按发酵形式来区分，则有：固态发酵和深层液体发酵。 4）按发酵工艺流程区分则有：分批发酵、连续发酵和流加发酵。 5）按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：厌氧发酵和通风发酵两大类型。 三、实验器材 1 菌种：金色链霉菌 2 培养基（）：葡萄糖4.2；氯化钠0.2；硫酸胺0.3；碳酸钙0.4；硫酸镁0.025；磷酸 二氢钾0.025；pH 6.0。 3 试剂：蒸馏水 4 其它：电子天平；三角瓶（500 ml） ；纱布；牛皮纸；细绳；灭菌锅；无菌操作台；酒精 灯；无菌吸管；摇床。 四、实验步骤 8 1 按上述培养基配方配制50 毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，用纱布 塞住

17、瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。 2 把物品放入灭菌锅中在121下灭菌1520 分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。 3用吸管从种子培养基将菌液接入灭菌后的培养基中，接种量为2 % 4将摇瓶放置在29 、 160 r/min 的摇床上培养。 5定时取样，以备后续测定。 9 实验四发酵液中残糖量的分析 一、实验目的 ： 掌握发酵液中的残糖量测定的原理和方法 二、实验原理 本实验葡萄糖含量的测定用DNS 法。 糖的测定方法有物理的和化学的两类。由于化学方法比较准确，常常使用。 还原糖的测定是糖测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。单糖都是还原 糖，利用单糖 、双糖和多糖的溶解度的不

18、同可把它们分开。用酸水解法使没有还原性的双糖， 彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，就可以求出样品中的还原糖的含量。 有几种方法可用于测定还原糖。在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇（1，2-烯二醇）。烯二醇 易被各种氧化剂如铁氰化物，3，5-二硝基水杨酸和Cu+氧化为糖酸。铁氰化物和二硝基水 杨酸盐的还原作用是还原糖定量测定的基础。 还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范 围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖 的量。 三、实验器材 1 待测溶液：发酵液。 2 试剂： 1)3，5二硝基水杨酸（DNS）把 6 3

19、克 3，5二硝基水杨酸溶于262 毫升 2N 的氢氧 化钠中，将此溶液与500 毫升含有182 克酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入5 克 重蒸酚和5 克亚硫酸钠，充分搅拌至溶解，待溶液冷却后，用水稀释到100 毫升，存储 于棕色瓶中。 10 3 其它：pH 试纸；容量瓶（ 100ml） ；玻璃漏斗；吸量管（ 01ml，1ml，05ml， 5ml，10ml） ；试管；恒温水浴；沸水浴锅。 四、实验步骤 1 葡萄糖标准曲线制备 1)按下表制备九个管； 2)向九只试管中分别加入DNS 试剂，充分混合； 3)将九只试管放入沸水浴中加热煮沸5 分钟； 4)将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却； 5)向试管

20、中分别加入4 毫升蒸馏水，充分混合； 6)以空白试管做对照，于540 毫微米波长下，分别测定各管的OD 值； 7)画每管在 540 毫微米波长下的吸收值（作为纵坐标），对每管所含的葡萄糖微克数（作为 横坐标）的图，得到一条通过零点的直线。 管号 葡萄糖存储液（1mg/ml）(ml) 水（ ml） 最终浓度（ g/ml） 1 0 0.5 0 2 005 0.45 100 3 01 0.4 200 4 015 0.35 300 5 02 0.3 400 6 025 0.25 500 7 03 0.2 600 8 035 0.15 700 9 04 0.1 800 8)还原糖的测定 （1）根据经验，

21、将样品稀释N 倍，使稀释液中的葡萄糖含量在011mg/ml 的范 围之内； 11 （2）取蒸馏水1ml，稀释液1ml， DNS1.5ml 加入试管中； （3）在沸水浴中煮沸5 分钟； （4）在冰水浴中迅速冷却； （5）用比色管定容到5ml； （6）以参比做比较，在分光光度计上540nm 测定去其OD 值。 参比的操作为（2）步中将稀释液用蒸馏水代替。 3根据还原糖的OD 值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算残糖量。 12 实验五金霉素含量的测定 一、实验目的 掌握金霉素含量的测定原理和操作过程 二、实验原理 金霉素在440nm 下具有吸光度，通过测定发酵液中金霉素吸光度的变化，比较金霉 素标准曲

22、线，可以计算出发酵液中金霉素的含量。 三、实验器材 1 不同时间的金霉素发酵液 2 试剂：蒸馏水；固体草酸；2mol/LHCl 。 3 其它：电子天平；三角瓶（100ml） ；烧杯（ 50ml） ；恒温水浴锅；容量瓶（50ml） ；分光 光度计； pH 试纸；吸管。 四、实验步骤 金霉素含量的测定 1 取发酵液50ml 左右。 2 加入固体草酸，调节发酵液pH 在 1.21.4 之间，过滤。 3取适量滤液，稀释100 倍。 4取 1ml 稀释液加入5 ml 2mol/L 的 HCl 。 5100 水浴 5 min ，定容到50 ml；对照样品不加热。 6440nm 测定吸光度。 7 对比标准曲

23、线计算金霉素含量。 金霉素标准曲线 13 实验六发酵罐的熟悉及灭菌操作 （一）发酵罐的熟悉 一、装置介绍 1简介 本次试验所用FUS-15L 生物反应器是一个精心设计、精密加工装配而成的生物反应系统， 总容积 15L，工作容积10.5 升，能精确的测量温度、搅拌转速、PH 值和溶解氧浓度，并能精 确的控制温度、 搅拌转速和PH 值。配备有自动消泡装置及输送料液的蠕动泵系统。机械搅拌 装置位于罐盖上部，采用机械密封结构，具有可靠的抗污染密封性能。气体过滤器，具有过 滤效率高、流量大、阻力小、能耐重复蒸气消毒（耐蒸气消毒温度140） ，能有效而可靠 地虑出空气中杂菌，而且体积小，安装更换方便等优点

24、；主要管路均采用“O”型密封圈结构 的连接方式，可有效地防止因泄漏而导致发生污染。 该装置由罐体、管路系统、自动控制系统三大部分组成，安装、拆卸、清洁方便，容易维修 保养。 2 反应器特性 21 概述 反应器采用不锈钢材制成，经机械加工、 精细抛光后， 内、 外壁表面粗糙度不大于0.8um。 设计压力为0.2Mpa。 反应器工作温度125， 反应器搅拌功率为185W， 转速为 1501000 rpm, 搅拌器型式为两档六平叶拆卸式涡轮浆。加热器加热功率为750KW 。 22 罐体 （1）罐体的总容积15L，工作容积体10.5 升。 （2） 罐高 (H) 为 445mm，罐径（ D）为 200m

25、m，高径比H:D 为 2:2.1。 （3） 罐体夹套装有进出水口各一个，用于培养过程中恒温水、冷却水的循环或进、处，以 14 及高温灭菌时蒸汽加热、保温的进、出。 （4） 罐体夹套右侧上方装有压力表，便于观察蒸汽灭菌及补充冷水时夹套内的压力变化。 （5）罐体的下部右侧有两个直径25 的标准电极插孔，用于安装进口或国产的PH 及 DO 电极。 （6）罐体正面装有矩形视镜，背面配有圆形灯镜和专用照明灯具，以便于观察罐内培养液 的情况与叶面上部的其它空间。 （7）取样放料阀位于罐体下部，与蒸汽管道连接，可反复消毒灭菌。开启和关闭采用手动 顺时针和逆时针的旋转方式。该阀门可以在培养过程中作为取样阀又可

26、以在放料过程中作为 放料阀。 （8）搅拌器为两档六平叶拆卸式涡轮浆。 （9）反应器内壁装有可拆卸的4 块挡板，以增强培养过程中的混合效果。 （10）罐体下部装有单管气体分布器，消毒灭菌时可以通入蒸汽。培养过程可通入无菌空 气。 （11）罐体背面上部装有排气管道并与冷凝器连接，用于培养过程中的排气冷凝。 23 罐盖 罐盖用不锈钢材料制成，有“O”型密封圈与罐体法兰密封。罐盖的两侧装有可拆卸的手柄。 在罐盖中心装有搅拌器动力输出的“轴系总成”四周分布有9 个开孔 (见图 1 ).该 9 个孔的用 途分别为： 其中通用接口b 有 6 个，均为插针式接口，可用于补料、换液和酸、碱、消泡剂的加入及备 用

27、，并以硅橡胶垫圈与注射式密封针头及压帽互相衔接。连接硅橡胶管的注射式密封针头和 压帽可分别单独灭菌。之后，在火焰保护下插入即可。这里值得注意的是：在接种的时候打 开接种口a 进行接种操作时，由于开孔口径较大易于排气，致使罐内压力跌零。此时应加大 通气量，使罐内始终保持正压状态，同时，须使接种口处于火焰保护状态。操作时动作要快， 15 时间不宜过长，避免因操作因素造成污染。接口b 也可以作为压差式接种的接种口，接种完 毕应用消毒酒精棉封住接种口，并旋上螺口盖帽。 二、反应器管路系统 1管路系统流程示意图 16 2管路系统阀门标记一览表 序号代号名称 1 G-01 气体调节阀 2 G-02 滤器进

28、气阀 3 G-03 无菌空气阀 4 S-01 滤器消毒阀 17 5 S-02 夹套蒸汽阀 6 S-03 底阀消毒阀 7 S-04 滤器排气阀 8 S-05 蒸汽滤气排水阀 9 W-01 水泵进口阀 10 W-02 冷水旁路阀 11 W-03 水泵出口阀 12 W-04 冲洗阀 13 W-05 夹套回流阀 14 W-06 冷凝水阀 15 M-01 排料取样阀 3 阀门功能简介 （1）气体调节阀 该阀为装于流量计上的针型阀，用于培养过程中开启、关闭空气及调节空气的流量。球浮子 的中部最大处是为空气流量读数。 （2）滤器进气阀 消毒霉菌是关闭此阀以防止蒸汽通入空气流量计；消毒结束或进入培养阶段时，关

29、闭 S-01 阀， 开启此阀，使空气经过过滤器通入罐内。 （3）无菌空气阀 此阀用于将过滤后的无菌空气经气体分布器通入罐内。培养过程中，若遇到临时停电、停气 等故障时，先关闭此阀，既可保证罐内正压有能防止罐压急剧下降造成培养液倒流现象。 （4）尾气排气阀 消毒时调节排气量以控制罐内温度和压力。培养过程中调节尾气流量以维持罐压（保持进气 和排气的平衡）。 18 （5）滤器消毒阀 消毒时关闭G-02 阀，开启此阀， 蒸汽通入过滤器进行消毒，同时将蒸汽经过过滤器通入罐内。 （6）夹套蒸汽阀 消毒时开启此阀和W-11 阀，关闭 W-02，W-03 和 W-05 阀，蒸汽通过夹套，对罐内培养基进 行预热

30、， 防止在蒸汽直接通入罐内培养基中时由于产生过多的冷凝水而造成培养基体积增加。 （7）底阀消毒阀 消毒时，开启此阀和M-01, 对取样、放样阀（底阀）及取样管道进行灭菌。 （8）滤气排气阀 消毒时排去过滤器中的冷凝水，又可在培养过程中防止可能出现的回流管道的倒流现象出现。 （9）蒸汽过滤器排水阀 使用前开启此阀，排去冷凝水。 （10）水泵进口阀 发酵过程中用于循环泵往夹套通入循环水的阀门，消毒时关闭此阀以防止蒸汽进入泵内。 （11）冷水旁路阀 当水泵出现故障时，开启此阀，保证管路系统充满水。 （12）水泵出水阀 消毒时，关闭此阀，防止蒸汽进入水泵；快速冷却或培养过程中，开启此阀，冷凝水由水泵

31、进入夹套，进行温度控制。 发酵过程中用于循环泵往夹套通入循环水的阀门，消毒时关闭此阀以防止蒸汽进入泵内。 19 （13）冲洗阀 培养过程结束后，用皮管连接此阀，可对反应器内、外及环境进行冲洗。 （14）夹套回流阀 消毒时，关闭此阀，防止蒸汽经加热器进入水泵；快速冷却或培养过程中，开启此阀，冷却 水或恒温水经加热器排入下水道或通入水泵进行循环以控制温度。 （15）冷凝水阀 消毒或培养过程中，为减少培养液的损失，可开启此阀对排气进行冷却，使冷凝液返回罐内。 （16）加热器底阀 快速冷却或排污时，将加热器内的水排入下水道。 （17）温控切换阀 在培养过程中，开启此阀。而一旦温控电磁阀W-09 失灵时

32、，可关闭此阀，打开或关闭W-10， 即可维持手动冷却控温，又可对W-09 进行维修或更换。 （18）温控电磁阀 培养过程中，当罐内温度高于设定值时，自控系统开启此阀，冷却水加入夹套并流经此阀， 使温度恒温。 （19）温控旁路阀 培养过程中，关闭此阀。而一旦温控电磁阀W-09 出现故障时，关闭W-08，开启此阀，可代 替 W-09 阀，进行手动冷却控温。 （20）夹套排污阀 用于排放夹套内的水进入下水道。亦可在S-05 阀下面的疏水器出现故障时，排放夹套内的冷 凝水。 20 （21）排料排气阀 消毒时，开启此阀，蒸汽形成回路，对取样放料阀（底阀）及取样管路进行消毒，罐内液体 由此口排放。 （22

33、） 底阀 对取样放料阀（底阀）和取样管路消毒结束后，关闭此阀，防止由于冷却时，取样管路内压 力剧降，出现倒吸（抽真空）现象而产生污染。 （二）发酵罐的灭菌操作 简介：反应器的消毒灭菌在微生物发酵培养过程中非常重要，前期污染的主要原因就是消毒 不彻底，为确保培养过程在无污染的情况下进行，必须严格按实罐消毒灭菌程序进行操作。 反应器的消毒灭菌分为实消和冷却两步进行。 （一）实消步骤 1、关闭所有阀门。 2、向罐内注入待消毒的料液至一定体积（消后体积控制在10L） 3、打开电源总开关，及“搅拌”开关，并设置一定的搅拌速度（宜在200rpm 左右） 。 4、将控制机箱面板上的“手动/自动 ” 开关处于

34、关闭状态（即控制器处于检测状态）。 5、开启尾气排气阀G-04 和冷凝水阀W-06。 6、开启夹套蒸汽阀S-02、蒸汽虑气排水阀S-05，将蒸汽（约0.3-0.4Mpa ）通入夹套， 预热罐内液体。 7、当罐内温度达到8595左右时，开启滤器消毒阀S-01、滤气排气阀S-04，关闭冷 凝水阀 W-06，使蒸汽通入过滤器，并经由滤器排气阀S-04 和疏水器排放过滤器中的 冷凝水。 8、待过滤器中的冷凝水排尽后，（触摸滤器排气阀S04 下端的管子烫手即可） ，关闭滤 器排气阀S-04，然后开启无菌空气阀G-03，使蒸汽通入罐内。 9、当温度高于100时，罐内产生鼓泡翻腾，此时应关闭“搅拌”开关停止

35、搅拌。蒸汽 经排气冷凝器通过尾气排放阀G-04 向外排放。 此时应调节尾气排气阀G-04 到至略有 21 少量蒸汽排出即可。 10、当罐内温度上升至121（0.11Mpa） ，适当开启底阀消毒阀S-03、排料取样阀M-01 ， 使少量蒸汽经过排料取样阀M-01 排出，由“活”蒸汽对取样放料管路进行消毒灭菌。 待排放适当时间后（约20 分钟） ，先关闭排料取样阀M-01 和底阀消毒阀M-03 。 11、通过调节夹套蒸汽阀G-04、尾气排放阀S-02 或蒸汽进量，使反应器保温、保压 （ 121， 0.11Mpa）30 分钟，实消工作即告完成。 注意 ：在消毒灭菌过程中切记： （1）相关管道或区域均

36、应有蒸汽的进和出，使蒸汽形成活路，不能留有死角。 （2）经常开启滤器排气阀S-04，排放过滤器中的冷凝水，随后即关闭此阀。 （3）当罐内温度超过121时， 应尽量减少蒸汽进量，关闭或关小夹套蒸汽阀S-02，而不应 加大排气，以免液体携带而导致液体体积减少。 （4）液体体积在实消结束后，会出现增加或减少现象，这是在消毒过程中由于蒸汽的冷凝或 携带造成的。 （5）在消毒灭菌过程中应尽量避免蒸汽压力剧跌，一旦蒸汽压力低于罐内压力，罐内液体会 倒压进入管道和过滤器内。当这种情况出现时，应尽快关闭底阀消毒阀S-03，防止料液倒压 入过滤器内。 （二）冷却步骤 当实消灭菌结束后，应关闭底阀消毒阀S-03、

37、切断蒸汽源，开启“搅拌”开关，待压力降至 0.8Mpa 左右时充入气体方可冷却，否则易造成罐内压力剧降，出现罐压跌零甚至倒吸现象， 由此而带来污染。具体步骤如下： 1、检查空气源并将进入装置的空气压力调节至0.120.14Mpa ，开启“搅拌” 开关 （200rpm 左右） 。 2、开启冷凝水阀W06. 3、按下列顺序关闭各阀门： 22 (1)无菌空气阀G 03; (2)排料取样阀M01; (3)底阀消毒阀S03; (4)滤器消毒阀S01; (5)夹套蒸汽阀S-02。 4、按下列顺序开启各阀门，将无菌空气通入罐内： 1)气体调节阀G01; 2)滤器进气阀G02; 3)无菌空气阀G-03。 注意

38、： 待罐内压力降至0.08Mpa 左右时， 方可开启无菌空气阀G-03，避免罐压高于空气压力 造成倒压。 5、调节空气调节阀G-01 和尾气排放阀G-04，保持一定的罐压。 （0.05Mpa） 6、罐内通入无菌空气后关闭夹套排水阀S 05,开启下列各阀,和机箱面板上的分路 控制开关，即可进行快速冷却： (1)水泵出口阀W03; (2)夹套回流阀W05; (3)温控切换阀W08; (4)“冷却”开关; (5)“水泵”开关。 注意：在冷却过程中罐压的波动比较大，须密切注意观察，切不可使罐压跌零。 1、当罐温降至接近培养工艺所需的设定温度（相差约34）时，将温度手动控制 23 切换成自动控制，具体步

39、骤为： 2、(1)关闭机箱面板上的“冷却”开关； 3、(2)将机箱面板上的“手动/自动”开关处于开启状态，此时，控制器处于自动控 制状态；温度达到培养工艺所需的设定值时，消毒灭菌全过程完毕； 4、(3)按工艺要求，设置工艺所需各个参数，待接种。 注意：冷却过程中空气流量不要过大，搅拌速度可适当降低，并严格控制罐压，以防泡沫携 带量过多。 24 实验七木聚糖的发酵生产 一、实验目的 1.了解木聚糖酶；2.熟悉影响真菌产木聚糖酶的发酵条件；3.掌 握发酵实验的基本操作。 二、实验原理 木聚糖酶 ,英文名称 xylanase ，半纤维素酶系中最主要的组成部分。是一类组 成比较复杂的的酶， 是一种多聚

40、五碳糖， 并和纤维素分子存在着氢键连接和物理 混合。 狭义上的木聚糖酶指的是内切-1，4-木聚糖酶，广义上木聚糖酶的主要功 能是降解木聚糖分子，主要包括内切- -1，4-木聚糖酶（endo- -1， 4-D-xylanase,EC3.2.1.8） -D- 葡 萄 糖 醛 酸 苷 酶 （ -D-glucuronidases， EC3.2.239） - D-木糖苷酶（( - xylanxylohydrolase , EC3. 2. 1.37） - L - 呋 喃型阿拉伯糖苷酶（ -L-arabinofuranosidases ）酚酸酯酶。其中主要降解木聚 糖分子的是内切 -1，4-木聚糖酶，此酶主

41、要是通过内切木聚糖主链的- 1 ,4 - 木糖苷键，降解木聚糖主链骨架 27 ，使木聚糖分子降解成低木聚糖分子，并生 成少量的木糖。低木聚糖分子则在- D - 木糖苷酶的催化下，末端释放出木糖 残基。木聚糖酶的来源广泛，而且由于其组成不同，结构也很复杂。根据组成木 聚糖酶的分子量不同， 可以将木聚糖酶划分为高分子量木聚糖酶和低分子量木聚 糖酶。高分子量木聚糖酶一般含有269809个氨基酸残基， 而低分子量木聚糖酶 氨基酸氨基大约在182234个。 也可将木聚糖酶按照是否具有底物特异性将其分 为特异性木聚糖酶和非特异性木聚糖酶。 三、实验器材 1菌种：纯绿青霉 2基础产酶培养基： 麦麸 3 g，

42、酵母粉 0.2 g，硫酸镁 0.01 g，氯化钠 0.05 g， 磷酸二氢钾 0.05 g，定容到 1000 ml。121灭菌 30min。 3其它：电子天平； 250ml 三角瓶；电炉；灭菌锅；培养皿（5 个） ；试管； 25 无菌操作台；酒精灯；接种环；涂布棒；报纸；细绳；棉塞；牛皮纸；玻璃棒。 四、 实验步骤 1、按上述培养基配方配制100 毫升培养基，装入一只250 毫升三角瓶中， 加热使药品溶解后（保持低温加热） ，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备 灭菌。 2、用一个 100 毫升的三角瓶装入蒸馏水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎 紧，以备灭菌。 3、把物品放入灭菌锅中在121 时

43、灭菌 20 分钟，灭菌后放入已杀菌的无 菌操作台中。 4、待培养基和无菌水冷却至适宜温度时，在无菌条件下，将两支斜面的孢 子用无菌水制成悬浮液，用无菌吸管吸1ml 接入摇瓶的培养基中。 5、将摇瓶放置在 29 、160 r/min 的摇床上培养 2224 小时。在无菌条 件下，菌株接种到基础产酶培养基的三角瓶中，放置28，转速 160r/min 恒温 培养摇床上振荡培养5d。 26 实验八 木聚糖酶活力测定方法 木聚糖酶能够将木聚糖水解成木糖的还原糖类，这些还原糖能够与DNS 试 剂发生显色反应， 根据这个原理可用来测定木聚糖酶的活性。本实验利用木聚糖 （生化试剂） 为底物，加入一定量的粗酶液

44、反应一段时间后加入DNS，沸水浴 5 min 钟后，利用 721 可见光分光光度计测反应后的OD 值。本实验中， 酶活越高， 水解木聚糖生成的还原糖越多，其OD 值也会跟着增加，通过定义酶活含义，可 以测定出酶活，判断酶活的高低。 1木聚糖的制备 称取 50 g麦麸放入烧杯中，按1：10的料液比加入蒸馏水和一定量NaOH， 维持 pH 在 10左右，加热煮沸30 min，冷却后在 4000 r/min 转速下离心 15min， 取离心后的上层液体，按1：2 的体积比加入乙醇溶液，沉淀30 min，再在 4000 r/min 转速下离心 10 min，将得到的沉淀洗涤至中性，烘干，得到的即为木聚

45、糖。 2测定酶活使用试剂的配制 （1）DNS 的配制 称取酒石酸钾钠 182.09 g，溶于 500 mL 蒸馏水中，加热，于热溶液中加入 3,5二硝基水杨酸 6.39 g，NaOH 21.09 g，待溶液冷却至50以下，依次加入 苯酚 5.09 g， 无水亚硫酸钠 5.09 g， 搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮存预棕色瓶中，室温保存，放置一星期后即可使用。 （2）1的木聚糖底物溶液 (pH4.8) 溶液 A：0.2 mol/L 醋酸（准确量取 11.55 ml 冰乙酸溶于 1000 ml 蒸馏水） 。 溶液 B：0.2 mol/L 乙酸钠（称取 16.4 g无水乙酸钠

46、溶液 1000 ml 蒸馏水中）。 pH4.8 醋酸缓冲液的配制：溶液A 和溶液 B 混合比例为 2:3，并稀释一倍。 1的木聚糖底物溶液 (pH4.8)配制：按 1%的含量称取一定量的木聚糖溶于 配置好的缓冲液中。 1 g/L 木糖溶液配置：称取0.25 g 的木糖用 pH4.8 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解定 容至 250 mL。 3标准曲线的绘制 取 11 支试管按顺序加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、 2.0 mL 的 1 g/L 的木糖溶液，补水至2 ml，再各加入 3.0 mL 的 DNS 试剂，摇匀 27 后在沸水浴中保温显色5 min 后

47、，待冷却后，加入蒸馏水定溶至15 mL，摇匀， 自制木聚糖在 520nm处测其 OD 值，标准曲线见表3.2。 表 3.2 520 nm 下的 OD 值 木糖含量（ g/L）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 OD 值-0.022 0.143 0.359 0.593 0.711 0.892 1.172 4酶活的测定 （1）粗酶液的制备 取发酵液过滤，得到的上清液即为粗酶液。 （2）酶活的测定 取 0.1 ml 粗酶液加入 pH4.8 的醋酸缓冲液配制的1的木聚糖溶液 1.9 ml， 放入水浴锅中 50 水浴酶解 30 min，立即取出加入 3 ml DNS 溶液，至沸水裕 中反

48、应 5 min，冷却后加入 10 ml 水定容至 15 ml，混匀后，于 520 nm 处测其吸 光度，对照组为取0.1 ml 粗酶煮沸 15 min 灭活，其他条件不变。 （3）酶活力定义 酶活定义： 1 mL 粗酶液在 pH4.8、50下每分钟分解木聚糖产生1 g 木糖 为一个酶活单位。计算公式如下： 木聚糖酶活（ A）10 N D 2 1000/30 （3-1） 式中： N稀释倍数，本实验中为1。 D由待测溶液的吸光度值在木糖标准曲线上查出的对应的木糖的 毫克数。 10本实验加入反应的粗酶液量为0.1 ml，定义为 1 ml 粗酶液体积 (ml)。 1000木糖的毫克数换算为微克的比例系数。 30反应的时间为 30 min。 酶活力单位： U/ml X=XD*DF （2） 28 式中： X- 试样中木聚糖酶的活力， U/g( 或 UmL) ； DF-试样的稀释倍数； 酶活力的计算保留三位有效数字。