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1、课题 3 血红蛋白的提取和分离 【课题目标】 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取 生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、 电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今 后学习运用这些技术打下基础。 【课题重点与难点】 课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。 课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【导学诱思】 思考 1：分离生物大分子的基本思路是什么？ 思考 2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 思考 3： 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 思考 4：人们用鸡的红细胞提取DNA ，用人的红细胞提取血红蛋白的原
2、因是什么？ 一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法） ： 1、 概念：根据被分离蛋白质的， 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 来分离蛋白质的有效方法。 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对的蛋白 质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动， 路程，移 动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3、具体过程： A. 的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留； 的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。 B.（1）混合物上柱； （ 2 ） 洗 脱 开 始 ，的 蛋 白 质 扩 散 进 入 凝 胶 颗 粒 内 ； 凝 胶 颗 粒 相
3、 对 分 子 质 量 较 小 的 蛋 相 对 分 子 质 量 较 大 的 蛋 （1）（2）（3）（4）（5） B A 多 孔 板 的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外； （3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。 （4）不同的蛋白质分子完全分开； （5）的蛋白质行程较短， 已从中洗脱出来，的 蛋白质还在行进中。 缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显 变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 2、作用：能够抵制的对溶液的的影响， 维持 PH基本不变。 3、缓冲溶液的配制 通 常 由种 缓 冲 剂 溶 解 于 水 中 配 制 而 成
4、 。 调 节 缓 冲 剂 的 就可以制 得使用的缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常 结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） 电泳： 1、概念：指发生迁移的过程。 2 、 原 理 ： 许 多 重 要 的 生 物 大 分 子 ， 如等 都 具 有 在下， 这些基团会带上。 在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本 身、的不同使带电分子产生不同的， 从而实现样品中各种分子的分离。 3、分类： 电
5、泳 电泳。 测定（ 蛋白质相对分子质量）通常用十二烷基硫酸钠（ SDS ） 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的 多少以及分子的大小等因素。 为 了 消 除 静 电 荷 对 迁 移 率 的 影 响 可 以 在 凝 胶 中 加 入。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链 组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此 测定的结果只是。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋 白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于。 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处
6、理粗分离纯化纯度鉴定 1. 样品处理 阴 极 阳极 加入待分离 的样品 带电性质、分子大小和形 状的不同，使分子迁移速 分子向阳极移动缓冲液 琼 脂 胶 溶 液 槽 凝胶电泳原理示意图 (1) 红细胞的洗涤 目的：去除 方法：离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层 的红细胞液体倒入 再加入用的质量分数为0.9 的氯化钠溶液洗涤 低速离心（低速短时间） 重复 4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续 血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。 (2) 血红蛋白的释放 加到体积 ，再加40 体积 的 溶解细胞膜）
7、，置于上充分搅拌10 分钟（加速细胞破裂） , 细 胞破裂释放出血红蛋白. (3) 分离血红蛋白溶液： 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min ， 试管中的溶液分为4 层: 第 1 层（最上层）：甲苯层 第 2 层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体 第 3 层（中下层）：的水溶液层，的液体 第 4 层（最下层）：其它杂质的沉淀层 (4) 透析 2. 凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 取长 40 厘米，内径1.6 厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100 目尼龙纱包好。 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
8、b、 在橡皮塞顶部切出锅底状的， 在 0.5ml 的头部切下长 的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。 c. 剪尼龙网小圆片覆盖在上， 用的尼龙纱将橡皮塞包好， 插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管 的，另一端放入收集的收集器内 顶塞的制作： 插入安装了玻璃管的橡皮塞 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择：。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸 泡于中 充分 溶胀后，配 成。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 固定：将色谱柱处置固定在支架上 装填：将一次
9、性的缓慢倒入内，装填时轻轻 敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml 的 20mmol/l 的 磷酸缓冲液（ pH为 7.0 ）充分 12小时。 3）样品加入与洗脱 （1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与 平齐，关闭出口 （2）加透析样品 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用将 1ml 的样品加到色谱柱的 样品渗入凝胶床： 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 收集一试管连续收集 思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意 义？
10、 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收 集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、 粗分离、 纯化和纯度鉴定。 首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理； 再经过透析去除分子量较小的杂质，即（） ；然后通过凝胶色谱法将相对分 子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（） ； 最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（） 。 3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。 SDS 聚丙烯
11、酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 电泳方法步骤 1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 2）SDS 聚丙烯酰胺凝胶制备 3）样品处理： 4）把凝胶固定于电泳装置上 5)加样：按顺序加样，加样量通常为10 25 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红 细胞破碎后 ( 即进行凝胶色谱分离之前) 的样品和凝胶色谱分离之后的样品 6)电泳 7）剥胶 8）染色 9)脱色 10)观察结果 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。 三 实验结果分析与评价 观察血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋 白的原因。 此外，离心速度过高和时间过
12、长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯 净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区 带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的 效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准 蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的 对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。 课堂练习1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质( ) A路程较长
13、，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快 C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快 2.蛋白质提取和分离分为哪几步( ) A样品处理、凝胶色谱操作、SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱 操作、纯化 C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、 粗分离、纯度鉴定 3.在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是( ) A磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程B血红蛋白是一种两性物质，需要酸 中和 C防止血红蛋白被02氧化 D让血红蛋白处在稳定的pH 范围内，维 持其结构和功能 4在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U 形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发 现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明( ) AFe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 BFe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极 移动 CFe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 DFe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极 移动 5.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（） A. 加样前， 打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D. 用吸管小心的将1ml 透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面