抗氧化酶活性等测定方法.pdf

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1、实用文档 文案大全 叶绿体的提取 一、试剂配置 1、 PBS 提取 液： 每L水 依次 加入MES(195.2 0.05=9.76g) 、山 梨糖 醇 (0.33 182.2=60.126g) 、 NaCl （0.010 58.5=0.585g） 、 MgCl （0.002 95=0.19g） 、 EDTA （ 292.25 0.002=0.5845g） 、 KH 2PO4 （200 0.0005=0.1g） ； 使用时加入ASA-Na （198.1 0.002=0.3962g）; 2、悬浮液：将PBS 提取液中的MES 换为 238.3 0.05=11.915g 的 HEPES（238.3

2、0.05=11.915g） ； 3、80%Percol： 80ml 原液 +20ml 水； 40%Percol：40ml 原液 +60ml 水； 实际配制： PBS 提取液 2000ml(3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *20ml*3 次=1080ml), 悬浮液 100ml（3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *1ml*3 次=54ml）; 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml. （3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *3ml*3 次=162ml ） 二、提取步骤 1、10g 鲜样加 20ml 提取 PBS（50mM MES PH6.1 ，含 0.

3、33M 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM MgCl2，2mM EDTA ，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加） 2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4 层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体 膜破碎） 3、滤液 2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平 转头，加速度调到9)，约经 30s 后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min 左右完成； 4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物； 5、用 1ml 悬浮液（ 50mM HEPES pH 7.6 ，含 0.33 m

4、M 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM MgCl2，2mM EDTA ， 0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加） 将沉淀悬浮， 在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷， 或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶 绿体悬浮时要浓点，含叶绿素2mg.ml -1 以上，这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5，可以不做 ) 8、用 Percol 试剂进行梯度离心（将3ml 含有 80%Percol（ 原液按 100%算）铺在 10ml 离心管下层，再把 3ml 40

5、%Percol 铺在离心管中层，然后将1ml 叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）1500g 2-3min （用水平离 心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到1） ，下降也要缓慢下降，否则会破碎Percol 的浓度梯 度层的形成，取出会看到3层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒，40-80%的 Percol 之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体; 9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到1mg.ml -1； （ 计算：取叶绿体悬浮液 0.1ml ，加 4.9 ml 80%的丙酮，摇匀后于1000g 离心 2min，上清液置于1cm 的比色杯，在625nm 上比色，按照

6、公式计算： OD625nm 50/34.5=叶绿素 mg/ml ） 10、测定叶绿体的完整性，完整率达到85-95%； 参考： Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydrogen peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018. 实用文档 文案大全 取上述制备的完整叶绿体进行如下测定： 1、 用 50mM PBS （ 保护酶

7、或其他测定项目的缓冲液）稀释 2-5 倍，用于测定SOD、POD、CAT、APX ； 2、 用冷丙酮稀释2 倍，取 0.5ML 提取液用于测定H2O2； （本试验中用 0.2 mol/L HClO 4稀释 ） 3、 用 5%的 TCA 稀释 2-5 倍，取 1.5ml 用于测定MDA ； 4、 用乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1 稀释，用于测定叶绿素； 抗氧化酶（ SOD、POD、CAT、APX）活性测定方法 一、 超氧化物歧化酶（ SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS，pH7.8)： A 母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠

8、溶液: 取 Na2HPO4 12H2O（分子量358.14）71.7g； B 母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4 2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A 母液 (Na2HPO4) 228.75ml，B 母液 (NaH2PO4) 21.25ml，用 蒸馏水定容至1000ml。 参考文献： 李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267268。 （2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至 1000ml。

9、（3）30M EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na 2用磷酸缓冲液定容至 100ml。 （4）60M 核黄素溶液：取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮蓝四唑 (NBT) 溶液：取0.1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml，避光保存。 （上述试剂先配好，放到4度冰箱，用之前临时按下面的方法配，然后放在4 度冰箱中，不要在最上层， 避免见光，第一组样品加好后拿出来加，加完后放回冰箱，第二组的样品加好后再拿出来加） 酶液制备： 取 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50m

10、mol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g 下离心 20min ， 上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以 60 个样为准 )：分别取Met 溶液 162ml，EDTA-Na 2溶液 0.6ml（加的量和前 面的浓度要核对） ，磷酸缓冲液5.4ml，NBT 溶液 6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； SOD 反应混合液：3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml( 实际配置200ml) （2）分别取3ml 反应混合液和30 l（可视情况调整，最好先做一个浓度梯度，看加多少合适，如果 量太少，

11、最好稀释后再加，这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管的底部，要靠着试管壁打下去先加 酶液，后加反应液，加好后摇一摇，看看试管上是不是有雾气，最好拿纱布把试管下边擦一下，免得雾气 挡住光线照过去） ； （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux 光照下反应20min ； （ 照光很重要， 试管要选择相同规格的， 实用文档 文案大全 因为不同的试管透光率是不一样的，试管架不要选择遮光的，这个最好分组做，同时几组做相互之间会遮 光，每一组一个重复，就是每一组中都要有所有的处理，且都要有一个最大管，处理多的话，把根和叶分 开做，最大管放在中间） 同时做两支对照管，其中1 支试管取3ml 反应混合

12、液加入30 l PBS（不加酶液）照光后测定作为最大 光还原管，另1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。 （5）酶活性计算：SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原50所需酶量（ 测的样品值要在最大管的一 半左右才合适，否则要调整酶量）为 1 个酶活单位（ u） 。 SOD 总活性( Ack-AE ) V/ （1/2Ack W Vt） SOD 比活力 SOD 总活性 /蛋白质含量 SOD 总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW ） ；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照 管的吸光度；A

13、E为样品管的吸光度；V 为样品液总体积（ml,1.6ml ，加入 PBS 的体积 )；Vt 为测定时的酶 液用量（ ml， 30ul） ；W 为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg） ；蛋白质含量单位为mg/g。 二、POD、CAT 酶活性的测定 粗酶液制备同SOD。 1、 过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法） （1）试剂配制： 0.2mol/L 磷酸缓冲液 (pH6.0) ：分别取A 母液 (Na2HPO4 ) 123ml 和 B 母液 (NaH2PO4 ) 877ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M ，pH6.0)； （2）反应混合液配制（以60 个样为准）： 取

14、200ml PBS(0.2M ，pH6.0)，加入 0.076ml 液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷 却后加入0.112ml 30的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。 POD 反应混合液： 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml(实际配置 200ml, 0.076ml, 0.112ml) （3）样品测定： 取 3ml 反应液并加入30l 酶液，以PBS 为对照调零，而后测定OD470 值（测定40 秒） 。 （边加样边 测定，测定前等待5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大） （4）酶活性计算：以每m

15、in OD 值变化（升高）0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。 POD=（ A470 Vt ）/（W Vs 0.01 t）(u/g min) A470 ： 为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重 (g)； t 为反应时间 (min)； Vt 为提取酶液总体积 （ ml， (1.6ml ） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml，30ul） 。 2、 过氧化氢酶（CAT ）活性测定 （1）试剂配制： 0.15mol/L 磷酸缓冲液 （pH7.0） ：取 A 母液 (Na2HPO4) 457.5 ml 和 B 母液 (NaH2PO4) 292.5 ml 混合后用 蒸馏水定容至1000ml。 实用

16、文档 文案大全 （2）反应液配制：取200ml PBS（ 0.15M，pH7.0） ，加入 0.3092ml 30% 的 H2O2（原液）摇匀即可。 CAT 反应液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *3ml*3 次测定 =162ml( 实际配置200 ml, 0.3092ml) （3）样品测定：取3ml 反应液加入0.1ml （可视情况调整）酶液，以PBS 为对照调零，测定OD240 （紫外）（测定 40s） 。 （4）酶活性计算：以每min OD 值减少 0.01 为 1 个酶活性单位（u） 。 CAT= A240 Vt / （W Vs 0.01 t）(u/g min) A240

17、： 为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重 (g)； t 为反应时间 (min)； Vt 为提取酶液总体积 （ ml， 1.6ml） ；Vs 为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml ） 。 三、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定（缓冲液为K） 1、试剂配制（按50 个样计算）： （1）0.05 mol/L K 2HPO4-KH2PO4缓冲液（ pH7.0）的配制： （A）K2HPO4 3H2O：228.22 0.05 0.61=6.9607g （B）KH2PO4：136.09 0.05 0.39=2.6538g，以上两者混合起来用去离子水定容到1L 。 （ 2 ） 0.1 mM EDT

18、A-Na 2： 取 0.01861g EDTA-Na 2 用PBS溶 液 定 容 到500 ml （ 372.24 g/M 0.1mM500ml=0.01861 g ） ； （3）5 mM AsA ：取 0.044g 抗坏血酸用PBS 溶液定容到50ml（现用现配， 176.13g/M5mM 50ml=0.044 g） ； （ 4 ） 20mMH2O2： 取0.2ml,30%H2O2用 去 离 子 水 稀 释 到100ml （ 30% H2O2为 550g 30%/(34.01g/M0.5L)=9.703M ） 。 实际配置 0.1 mM EDTA-Na2： 3 个处理 *2 个品种 *3 次

19、重复 *1.7ml*3 次测定 =91.8ml; （实际配置 250 ml,0.009305g ） 5 mM 的 AsA: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml,0.044g ） 20mM H2O2: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3 次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml,0.1ml ） 2、酶活性的测定（以2 ml 体系测定） （1） 取 0.10 ml 酶液（可视情况调整） ， 加入 1.70 ml 含 0.1 mM EDTA-Na 2的 PBS （0.05 mol/L ， pH7.0） ， 再

20、加入 0.10 ml 5 mM的 AsA ，最后加入0.10 ml 20mM H 2O2，立即在 20下测定 D290（紫外）值在40s 内（ 测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点）的变化，计算单位时间内AsA 减少量和酶活性（室 温下测定，缓冲液调零）。 计算公式： OD/ t Vr VT Ad Vt W OD 为反应时间内吸光度的变化（40 秒吸光度 0 秒吸光度）；t 为反应时间（40 秒） ；Vr 为反应 液体积（ 2mL） ；VT 提取液体积（1.6mL） ；A 为消光系数（2.8mM -1.cm-1） ；d 为比色杯厚度（ 1cm） ；Vt 测定液体积（0.1mL） ；W 为

21、样品鲜重（0.2g） 。 四、超氧阴离子自由基（ O2 .-）产生速率的测定（羟胺氧化法） 实用文档 文案大全 1、试剂的配制 （1）1mM 盐酸羟胺溶液：称取0.02085g 盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml ； （2）17mM 对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g 对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3 配制）加热溶解后定容至400ml； （3）7mM -萘胺溶液：称取0.4008g -萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1 配制）定容至400ml。 实际配置 PBS（0.05M，pH7.8）: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.5ml*3次测定 =27ml; （实

22、际配置100 ml） 1mM 盐酸羟胺溶液: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100 ml,0.00695g ） 17mM 对氨基苯磺酸: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100 ml,0.2944g） 7mM -萘胺溶液： 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1ml*3 次测定 =54ml; （实际配置100 ml,0.1004g） 2、O2 .-含量的测定 （1）样品液提取方法同SOD 测定； （2）取 0.5ml 提取液（酶液） （可视情况调整用量）中加入0.5ml PBS（

23、0.05M，pH7.8） ，1ml 1mM 盐 酸羟胺溶液后摇匀。 （3）在 25下保温1 小时； （4）依次先加入1ml 17mM 对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM -萘胺，混合后快速摇匀； （5）在 25下保温20min 后在 3000 g 下离心 3min 后马上进行测定（或置于冰箱待测）； （6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530 值（测定）； （7） O2 .-含量的计算： 由测得的 OD530， 查 NO2 -标准曲线得到 NO 2 - ； 根据羟胺与O2 .-的反应式： NH 2OH 2O2.-H + NO2 - H 2O2 H2O 计算 O2 .-，即 N

24、O 2 - 2=O 2 .-；再根据样品与羟胺反应的时间和样 品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmol min -1mg-1 蛋白表示，也可以nmol min -1g-1 鲜重表示）。 O2 .-产生速率 =（C V）/（t W） （nmol min -1g-1 鲜重） C 为标准曲线上查得的浓度(umol/L) ；V 为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t 为反应时 间(60min) ； W 为样品鲜重 (叶绿体实际质量g) 参考文献： 王爱国，罗广华植物生理学通讯，1990， （6） ：5557 五、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法） 1、试剂的配制 （1） 考马

25、斯亮蓝溶液配制：称取 100 mg 考马斯亮蓝， 溶于 50 ml 90乙醇中， 加入 100 ml 85 （W/V ） 的磷酸，再用蒸馏水定容到1。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。 （2）100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA 加水溶解后定容至100 ml ，再从中吸 取 40ml 用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA 定容至 100ml 即为 100 g/ml 标准 BSA 溶液）。 实际配置 0.05M ， pH7.8 磷酸缓冲液：3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.08ml*3 次测定 =0.3456ml; （

26、实际配置100 ml,） 考马斯亮蓝溶液: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *2.9ml*3 次测定 =156.6ml; （实际配置200 ml， 20mg） 实用文档 文案大全 2、样品可溶性蛋白含量的测定 （1）样品可溶性蛋白含量测定：取20 l 提取液（酶液）加入80 l，0.05M，pH7.8 磷酸缓冲液（即稀 释成 0.1ml 提取液），再加入2.9ml 考马斯亮蓝溶液，反应2min 后测 OD595（以 100 l 缓冲液加2.9ml 考 马斯亮蓝为对照调零） 。 （2）蛋白质含量计算： 可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C VT)/(W VS 1000) C 为标准曲线查得

27、的蛋白质含量（ g） ；VT为提取液总体积（稀释后的体积 ml） ；VS为测定时所用提 取液体积（ ml，20 l） ； W 为样品鲜重（ g） 。 过氧化氢（ H2O2）含量的测定 一、试剂配制： 1、0.2 mol/L HClO4：取 10.05g HClO4溶解于 0.5L 的水中； 2、4 mol/L KOH ：取 112 g KOH 溶解于 0.5L 的水中； 3、0.1 mol/L ，pH 6.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4 12H2O5.6407g+NaH2PO4 2H2O5.3433g 用去离子水定容到 500ml ； 4、显色液： 100mL、0.1 mol/L 、pH 6

28、.5 的磷酸缓冲液+25 L N,N -二甲基苯胺 +10 mg 4- 氨基氨替吡啉； 5、过氧化物酶溶液（250 U/mL ） 二、测定步骤： 称取植株根和叶片组织各0.5g，分别置于研钵中，加入 1.6 mL 预冷至 4的 0.2 mol/L HClO 4，冰浴匀 浆，于 10 000 g 离心 5 min（4） ， 取上清液， 加 4 mol/L KOH 调 pH 值为 7.5 后，再于 10 000 g 离心 5 min （4） ，取上清液1 mL ，加 0.4 mL 显色液和0.1mL 过氧化物酶溶液（250 U/mL ） ，用岛津 UV-1601 分光 光度计测定波长550 nm（

29、可见）处光密度值的变化，H2O2含量以 mo l/gFW 表示。 （用什么调零？） 三、计算方法： （要做标线？ ） 参考：过氧化氢（H2O2）含量的测定参照Uchida 等(2002)方法并加以改进。 还原型谷胱苷肽GSH 2 试剂配制 （1）1mM GSH 标准液 10mL（现用现配 ） ：称 3.0733mgGSH,加蒸馏水至10mL。 (不要 ) （2）5磺基水杨酸500mL：25g 溶于 500mL 水中。 （3）6mM DTNB ：称取 0.118905g DTNB 溶于 50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。 （4）2mM NADPH ：18.1mg NADPH 溶于 10

30、mL PBS 中。 （5）1mMGSSG 标准液 10mL：6.126mg GSSG 加 PBS 至 10mL。(不要 ) 实际配置 0.1M PBS(pH 7.5): 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.5ml*3次测定 =27ml; （实际配置50 ml） 6mM DTNB: 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.2ml*3 次测定 =10.8ml; （实际配置 50 ml， 实际用量 0.1189g） 2mM NADPH: 3个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3 次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量 18.1mg） (1U)GR : 3

31、 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3 次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量10ml） 5磺基水杨酸：3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.01ml*3次测定 =0.54ml; （实际配置10ml）(实际用量 0.5g/10ml) 实用文档 文案大全 0.5mM PBS: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1.5ml*3次测定 =81ml; （实际配置100 ml） 乙醚（二乙醚）: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *10ml*3 次测定 =540ml; （实际配置1000 ml） PBS Buffer 0.5mM: 3 个处理 *2

32、 个品种 *3 次重复 *1.5ml*3 次测定 =81ml; （实际配置150 ml） 2-乙烯吡啶 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.2ml*3 次测定 =10.8ml; （实际用量20 ml ） 乙醚 : 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *10ml*3 次测定 =540ml; （实际用量1000 ml） 1标线制作： 配制浓度为0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的标准 GSH 溶液（吸取上述标准液 各 0.1mL）加入0.5mL 0.1M 磷酸钠Buffer （pH7.5）(含 5mM EDTA) ，0.2mL 6

33、mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GR （谷胱甘肽还原酶）(sigma),从 0.1mL GSH 启动反应， 测定 650s 的 A412（OD412） ， 绘制标准曲线。以PBS 代替 DTNB 作空白。 3 GSH（还原型谷胱甘肽）及 GSSH（氧化型谷胱甘肽） （1） 取 1g 新鲜叶片， 加入 10 L （可以取 0.2g 鲜样，加 1.6ml 提取液 ） 5磺基水杨酸， 研磨后在14000g 离心 10 分钟，取 1mL 上清液，加入1.5mL,0.5mM PBS （ pH7.5）中，再用 5mL 乙醚（二乙醚）抽取二次 （杂质会融到乙醚层中，而乙醚处

34、于整个反应体系得上层，你直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可，反复进行 两次即为抽取两次） ，此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。 各取 1mL 上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（ 原装试剂浓度）混合至 乳胶状， 在 25反应 1 小时，再用 5mL 乙醚（原装试剂浓度 ）抽提 2 次，此提取液用于分析GSSGGSSG 氧化型谷胱甘肽，GSH还原型谷胱甘肽不能够直接测出，需测出氧化型和还原型谷胱甘肽含量，即 总的谷胱甘肽含量，然后减去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSH） ） （2）取反应混合液（0.5mL 0.1M

35、 PBS(pH 7.5)(内含 5mM EDTA) ，0.2mL 6mM DTNB ，0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GR（ sigma） ，由加入0.1ml 提取液开始反应，测OD412，在 25下，反应650s（大 约十分钟 ） ，分别计算总谷胱苷肽及GSH 含量。以不加DTNB ，加相应剂量的PBS 作空白。 GR（谷胱苷肽还原酶）测定 一、 试剂配置 50mM PBS （K） （pH 7.0，含 0.2mmol EDTA, 与 APX 的相同）：K2HPO4 3H2O 6.9607g+KH2PO4 2.6538g 混 合后定容到1L；然后加入292.25 0.2=58

36、.45gEDTA; 10mM GSSG （用水配 ） ：612.63 10 0.001=6.126g 溶于 1L 水中 ; 2.4mM NADPH （用 PBS 配） ：833.4 2.4 0.001=2.0g 溶于 1L 水中 . 实际配置 50mM PBS（K）: 3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *1.7ml*3次测定 =91.8ml; （实际配置150 ml, 实际用量 58.45g*0.15=8.7675g ） 10mM GSSG: 3 个处理 *2个品种 *3次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml, 实际用量 6.126g*0.05=0.3063

37、g ） 2.4mM NADPH:3 个处理 *2 个品种 *3 次重复 *0.1ml*3次测定 =5.4ml; （实际配置50 ml,实际用量 2.0g*0.05=0.1g ） 二、测定步骤 用 3mL 比色杯， 依次加入 1700 L 50mM PBS（K） （pH 7.8，含 0.2mmol EDTA ） ，100 L 10mmol GSSG ， 实用文档 文案大全 100 L 2.4mmol NADPH， 100 L 酶液（叶绿体悬浮液，与APX 相同）启动反应，25，以 NADPH 启动 发应（ 指最后加NADPH ） ，测定 OD340，1min 变化值，吸光系数2.8mM -1cm-1，不加 NADPH 为对照（ 调 零） 。 四、计算方法： OD/ t Vr VT Ad Vt W OD 为反应时间内吸光度的变化（60 秒吸光度 0 秒吸光度）；t 为反应时间（60 秒） ；Vr 为反应 液体积（ 2mL） ；VT 提取液体积（叶绿体稀释后的体积）；A 为消光系数（ 2.8mM -1.cm-1） ；d 为比色杯厚度 （1cm） ；Vt 测定液体积（ 0.1mL ） ；W 为样品鲜重（叶绿体质量）。