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1、1/ 20 目录 1. 概述 2. 验证范围 3. 验证目的 4. 验证参考文件 5. 验证小组名单 6. 验证小组职责 7. 验证内容 8. 结论与评价 9. 再验证周期 2/ 20 1. 概述 1.1. 本公司的洁净区分为A 级、B 级、C 级和 D 级，拟定用于洁净区表面消毒的有三 种消毒剂： 75%乙醇、0.1%新洁尔灭溶液、 2%甲酚皂溶液。本次验证方案将选用以上3 种消毒剂分别进行验证试验。 1.2. 消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期见下表： 序号名称消毒对象消毒方法有效期 1 75%乙醇用于设备表面、器具和手消毒。 采 用 擦 拭 或 喷 洒方式 密闭保存7 天 2 0.
2、1%新洁 尔灭溶液 用于地面、墙面、器具、清洁布、 拖布和洁净鞋的消毒 采 用 擦 拭 或 浸 泡方式 密闭保存7 天 3 2%甲酚皂用于水池和地漏、地面的消毒用于液封密闭保存7 天 备 注以上消毒剂浓度均为体积分数比。 1.3. 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利用消 毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10 分钟，利用消毒剂进行浸 泡消毒的不少于 5 分钟。 1.4. 为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。 实验室考察部分，定量悬浮试验法适用于浸泡或液封方式的消毒方法；表面实验法适用 于擦拭或喷洒方式的消毒方法
3、。洁净区设施表面材质有不锈钢、镀锌板及玻璃三种，故 表面试验法选用不锈钢载片、镀锌板及玻璃载片模拟洁净区设施表面进行验证试验。现 场考察试验部分选择冻干车间的配液间（C 级洁净区）、灌装间 (A/B 级洁净区 )、灌装间 操作人员手部消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。 1.5. A/B 级洁净区使用的消毒剂需经0.22 m 除菌过滤。 2. 验证范围 本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、 地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。 3. 验证目的 通过消毒剂消毒效果及有效期的确认，科学制订消毒程序，以保证各洁净级别的操 作间及设备
4、外表面、人员手部按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒防止污染的效果。 4. 验证参考文件 药品生产验证指南（2003 版） ； 医疗机构消毒技术规范 （2012年版） ； 中国药 典 （2010年版） ； 药品 GMP 指南-无菌药品、 现代医药工业微生物实验室质量管理 与验证技术。 5. 验证小组名单 3/ 20 组长 姓名 职务/职称部门 * 经理质量部 成员 * 车间主任生产部 * QC 主管质量部 * QC 质量部 * QA 主管质量部 6. 验证小组职责 7. 验证内容 7.1. 验证前参与实施验证的人员必须已经接受本方案的培训且考核合格。见附表1。 7.2. 验证前准备 7.2.1.
5、 菌种 7.2.1.1. 试验微生物以金黄色葡萄球菌作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆 菌作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；白色念珠菌作为致病性真菌的代表。在上述规定的 菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。 7.2.1.2. 75%乙醇、2%甲酚皂为中效消毒剂， 0.1%新洁尔灭为低效消毒剂，均不具备 杀灭细菌芽孢功能，根据上述内容，本次验证所用菌种见下表： 序号名称序列号类别 1 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003 细菌 2 大肠埃希菌CMCC(B)44 102 细菌 4 白色念珠菌CMCC(F)98 001 真菌 7.2.1.3. 可接受标准：
6、标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。使 用的标准菌种不能超过第五代。 7.2.1.4. 应确认菌种名称、来源、代数，见附表2。 7.2.2. 试剂及培养基 7.2.2.1. 选用培养基见下表： 序号名称备注 4/ 20 1 营养琼脂培养基121，15min 灭菌备用 2 玫瑰红钠琼脂培养基121，15min 灭菌备用 3 胰酪胨大豆琼脂培养基121，15min 灭菌备用 7.2.2.2. 稀释液、冲洗液： 0.9%无菌氯化钠溶液、 pH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液。 7.2.2.3. 可接受标准：所有试剂、培养基的规格、数量和保存条件满足要求，且在有 效期内；脱水培养基呈流动
7、粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。 7.2.2.4. 试剂/培养基检查确认记录见附表3。 7.3. 消毒剂配制： 按清洁剂、消毒剂的配制与使用标准操作程序进行消毒剂配制。 7.4. 定量悬浮试验 7.4.1. 目的： 0.1%新洁尔灭溶液、 75%乙醇溶液、 2%甲酚皂溶液消毒效力的确认（定 量悬浮试验法）。 7.4.2. 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于30 35培养 1824h 即得，培养后微生物浓度应不少于10 5cfu/ml。取白色念珠菌接种于改 良马丁液体培养基中，于2328培养 2448h 即得，培养后微生物浓度应不少于 10 5cfu/ml。
8、7.4.3. 将配制好的 0.1%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液或 2%甲酚皂溶液）按 9ml/支 分注于 27 支无菌具塞试管中， 按照“5 分钟组 ” 、“10 分钟组 ” 和“15 分钟组 ” 共 3 组每组 9 支，进行分组编号。 7.4.4. 取供试菌液（10 5cfu /ml 的金黄色葡萄球菌菌液， 105cfu /ml 的大肠埃希菌菌液， 10 5cfu /ml 的白色念珠菌菌液）1ml 按照下表，分别接入到盛有 9ml0.1%新洁尔灭溶液（或 75%乙醇溶液或 2%甲酚皂溶液）的试管中（已进行10倍稀释） ，轻轻摇动，混合均匀， 并立即开始计时。 菌种名称5 分钟组10 分钟组
9、15 分钟组 金黄色葡萄球菌1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支 大肠埃希菌1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支 白色念珠菌1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支1ml/支，共 3 支 7.4.5. 试验方法 分别在 5 分钟、10 分钟和 15 分钟取接种细菌的消毒液， 倾入过滤杯滤过， 然后各用 0.9%无菌生理盐水 50ml 清洗滤膜，滤过，重复用 50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共3 次。 取下滤膜，含细菌的膜放入营养琼脂平板内，含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含 菌膜面向上。 细菌于 30-35的生化培养箱内培养3
10、 天，真菌于 23-28的霉菌培养箱内 5/ 20 培养 5 天。培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。 7.4.6. 阳性对照 分别将 10 5cfu/ml 金黄色葡萄球菌菌液、 105cfu/ml 大肠埃希菌菌液、 105cfu/ml 的白 色念珠菌菌液逐级稀释至浓度为10100cfu/ml，取稀释菌液1ml 于平皿中，倾注冷却 至 45营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于30-35的生化 培养箱内培养 3 天，真菌于 23-28的霉菌培养箱内培养5 天。培养结束后对平板上的 菌落数进行计数，记录计数结果。 0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认记录见附表4
11、 75%乙醇溶液消毒效力确认记录见附表5 2%甲酚皂溶液消毒效力确认记录见附表6 7.5. 表面实验 7.5.1. 目的:由于 75%乙醇溶液、0.1%新洁尔灭溶液要通过擦拭消毒，故选用不锈钢载 片及玻璃载片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。 7.5.2. 工作菌液制备同 7.4.2.项下菌液制备。 7.5.3. 染菌不锈钢载片制备：将经灭菌的不锈钢载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色 葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌含菌量为1 10 85 108CFU/ml 的菌液 0.1ml，并均 匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备 两个染菌不锈钢载片；染菌
12、玻璃载片制备：因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻 璃载片进行染菌试验。进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌 面积（ 50mm 50mm） ，标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。 7.5.4. 取样 7.5.4.1. 试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5min、 10min、15min，不锈钢载片、镀锌载片及玻璃载片每个作用时间分别制备2 个。作用结 束后，用接触碟取样（接触碟规格：55mm，取样面积为25cm 2） 。取金黄色葡萄球菌 用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取大肠埃希菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟；取 样白色念珠菌用玫瑰红钠琼
13、脂培养基接触碟。接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌 培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面 均匀接触 10 秒左右，盖上碟盖。 7.5.4.2. 对照组：对照组的活菌浓度同工作菌液的制备。阴性对照：用接触碟在已灭 菌的载片上（未染菌片的载片）按压取样，操作同上。每种载片及每种接触碟平行制备 两份。 7.5.5. 培养：将取样金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的接触碟倒置于3035培养 3 天 计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于2328培养 5 天计数计数。 7.5.6. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml） ，并换算为对数值 （N） ， 6/
14、20 并按下式计算杀灭对数值： 杀灭对数值 (KL) 对照组平均活菌浓度的对数值 （NO） 试验组活菌浓度对数值 （NX） 7.5.7. 可接受标准：杀灭对数值 (KL) 应不低于 3 个对数单位。 75%乙醇溶液、 0.1%新洁尔灭溶液消毒效力确认（表面实验）见附表7。 7.6. 消毒效力现场考察试验 7.6.1. 目的：确认消毒剂对相应设施的实际消毒效力。 7.6.2. 操作：生产车间岗位操作人员按照洁净区操作间清洁标准操作程序、 洁净 区水池、地漏清洁标准操作程序 、 洁净区人员手部卫生清洁标准操作程序、 洁净区 清洁用具清洁标准操作程序 、 洁净区工作服清洁标准操作程序进行清洁消毒。分
15、别 选取如下试验现场： 7.6.2.1. 冻干车间的配液间（ C 级洁净区）顶棚、墙面、地面、工作台面，地漏、水 池； 7.6.2.2. 冻干车间的灌装间 (A/B 级洁净区 ) 顶棚、墙面、地面、工作台面、设备表面； 7.6.2.3. 冻干车间灌装间 (A/B 级洁净区 )操作人员手部； 7.6.2.4. 冻干车间 B 级洁净区的工作鞋、清洁布、拖布。 7.6.3. 取样检测 7.6.3.1. 消毒 15 分钟后，由 QC 人员到试验现场，按照冻干C线洁净区（室）表 面微生物监测标准操作程序进行洁净区表面微生物的取样检测； 7.6.3.2. 用浸泡或液封方式（地漏、水池、工作鞋、洁净布、拖布
16、）的采用无菌吸管 取浸泡液或液封液1ml，于胰酪胨大豆琼脂培养基平板培养； 7.6.3.3. 灌装间 (A/B 级洁净区 )操作人员，采用75%乙醇进行手部消毒。将配制好并 经过 0.22m 除菌过滤的 75%乙醇盛装于喷壶中，灌装间操作人员在生产开始时进行手 消毒，间隔 5 分钟、 10 分钟、 15 分钟、 20 分钟分别进行手指菌取样。 7.6.3.4. 连续逐日测定，共测定3 次。记录测定结果。 7.6.4. 可接受标准：所监测的洁净区的微生物均符合各自的洁净级别要求。 洁净度级别 表面微生物 接触碟 cfu/碟（设备、设施、工作服）5 指手套 cfu/手套 A 级 1 1 B 级5
17、5 C 级25 D 级50 75%乙醇溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表8 0.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表9 7/ 20 2%甲酚皂溶液消毒后试验现场表面微生物检测记录见附表10 75%乙醇用于手消毒效果实验记录见附表11 7.7. 消毒剂储存有效期确认试验 7.7.1. 目的：通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会发生 变化，符合要求。 7.7.2. 程序： 7.7.2.1. 在进行消毒剂有效期确认时，每天开启装消毒剂的容器（具塞磨口玻璃瓶、 手消毒器、消毒液喷壶）不少于3 次，其每次开启时间在12分钟，以模拟实际操作的 最差条件。 7
18、.7.2.2. 分别在消毒剂储存的第3 天、第 5 天、第 7 天、第 10 天进行取样，进行消 毒剂消毒效力的确认。 7.7.2.3. 结果计算：计算试验组和对照组的活菌浓度 （CFU/ml） ， 并换算为对数值（N） ， 并按下式计算杀灭对数值： 杀灭对数值 (KL) 对照组平均活菌浓度的对数值 （NO） 试验组活菌浓度对数值 （NX） 7.7.2.4. 可接受标准：在消毒液有效期末， 杀灭对数值(KL) 应不低于 3 个对数单位。 消毒剂储存有效期确认记录见附表12 8. 结论与评价 得出最终结论，并对此验证进行总评价。 9. 再验证周期 验证小组负责依据消毒剂消毒效果及存放时限验证的情
19、况，拟订消毒剂消毒效果及 存放时限再验证周期，报验证委员会审批。当出现以下情况是需立即重新进行验证： 9.1. 消毒液浓度发生改变时。 9.2. 增加新的消毒液时。 9.3. 环境检测中发现新的污染菌，不属于实验中的代表菌属时。 9.4. 消毒时间发生变化时。 YZ63024 X00，8/ 20 附表 1 人员培训记录 日 期 时 间 培训内容 消毒剂消毒效果及存放时限验证方案 清洁剂、消毒剂的配制与使用标准操作程序 参与人员 考核结果 记录人日 期 复核人日 期 YZ63024 X00，9/ 20 附表 2 标准菌种检查确认记录 菌种名称菌种编号来 源工作菌种代次工作菌种保存条件有效期至 金
20、黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 可接受标准 1. 标准菌种必须来源可靠、来源可溯、保存方法与条件合适。 2. 使用的标准菌种不能超过第五代。 结 论 检查人日 期 复核人日 期 YZ63024 X00， 10/ 20 附表 3 试剂 /培养基检查确认记录 名 称规 格供应商名称试剂批号失效日期 营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂 培养基 胰酪胨大豆 琼脂培养基 氯化钠 pH7.0 氯化钠蛋白胨 缓冲液 95%乙醇 甲酚皂 新洁尔灭 可接受标准 所有试剂、培养基的规格、 数量和保存条件满足要求， 且在有效期内； 脱水培养基呈流动粉末状，无结块，无潮解，且在有效期内。 结 论 检查人日 期 复核人
21、日 期 YZ63024 X00， 11/20 附表 4 0.1% 新洁尔灭溶液消毒效力确认 与消毒剂 作用时间 菌种名称 试验组菌落数（ cfu/ml） 10 -1 平均菌落 数 （cfu/ml） 杀菌率 1 2 3 5 分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 10分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 15分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 阳性对照 稀释级 菌种名称 10 -3 10 -4 10 -5 平均菌落 数 （cfu/ml） 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 确认结果评价： 操作人日期 复核人日期 YZ63024 X00， 12/ 20 附表 5 75%
22、乙醇溶液消毒效力确认 与消毒剂 作用时间 菌种名称 试验组菌落数（ cfu/ml） 10 -1 平均菌落 数 （cfu/ml） 杀菌率 1 2 3 5 分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 10分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 15分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 阳性对照 稀释级 菌种名称 10 -3 10 -4 10 -5 平均菌落 数 （cfu/ml） 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 确认结果评价： 操作人日期 复核人日期 YZ63024 X00， 13/ 20 附表 6 2% 甲酚皂溶液消毒效力确认 与消毒剂 作用时间 菌种名称 试验组菌落数（
23、cfu/ml） 10 -1 平均菌落 数 （cfu/ml） 杀菌率 1 2 3 5 分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 10分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 15分钟 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 阳性对照 稀释级 菌种名称 10 -3 10 -4 10 -5 平均菌落 数 （cfu/ml） 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 确认结果评价： 操作人日期 复核人日期 YZ63024 X00， 14/ 20 附表 7 75% 乙醇溶液、 0.1% 新洁尔灭溶液 消毒效力确认（表面实验） 序号 消毒剂 名称 工作菌液 杀灭对数平均值（ KL） 不锈钢载（ min
24、） 玻璃载片（ min） 镀锌载片（ min） 5 10 15 5 10 15 5 10 15 1 75%乙醇 金黄色 葡萄球菌 大肠 埃希菌 白色 念珠菌 2 0.1%新洁 尔灭溶液 金黄色 葡萄球菌 大肠 埃希菌 白色 念珠菌 可接受标准 阴性对照无菌生长； 杀灭对数值 (KL) 应不低于 3 个对数单位。 确认结果评价： 操作人日期 复核人日期 YZ63024 X00， 15/ 20 附表 8 75%乙醇溶液消毒后试验现场 表面微生物检测记录 监测区域 洁净 级别 平均菌落数 可接受标准是否合格 第一次第二次第三次 配液间顶棚 C 级 25CFU/接触碟 . （?55mm ） 口是口否
25、配液间墙面口是口否 配液间地面 口是口否 配液间工作台面口是口否 灌装间顶棚 A/B 级 A 级： 1CFU/ 接触碟 . B 级：5CFU/接触 碟.（?55mm ） 口是口否 灌装间墙面口是口否 灌装间地面口是口否 灌装间设备表面口是口否 灌装间工作台面口是口否 工作鞋 B 级 5CFU/接触碟 . （?55mm ） 口是口否 清洁布口是口否 拖布口是口否 确认结果评价： 操作人日 期 复核人日 期 YZ63024 X00， 16/ 20 附表 9 0.1%新洁尔灭溶液消毒后试验现场 表面微生物检测记录 监测区域 洁净 级别 平均菌落数 可接受标准是否合格 第一次第二次第三次 配液间顶棚
26、C 级 25CFU/接触碟 . （?55mm ） 口是口否 配液间墙面口是口否 配液间地面 口是口否 配液间工作台面口是口否 灌装间顶棚 A/B 级 A 级： 1CFU/ 接触碟 . B 级：5CFU/接触 碟.（?55mm ） 口是口否 灌装间墙面口是口否 灌装间地面口是口否 灌装间设备表面口是口否 灌装间工作台面口是口否 工作鞋 B 级 5CFU/接触碟 . （?55mm ） 口是口否 清洁布口是口否 拖布口是口否 确认结果评价： 操作人日 期 复核人日 期 YZ63024 X00， 17/ 20 附表 10 2%甲酚皂溶液消毒后试验现场 表面微生物检测记录 监测区域 洁净 级别 平均菌落
27、数 可接受标准是否合格 第一次第二次第三次 配液间水池 C 级 25CFU/碟 . （?55mm ） 口是口否 配液间地漏口是口否 确认结果评价： 操作人日 期 复核人日 期 YZ63024 X00， 18/ 20 附表 11 75%乙醇用于手消毒效果实验记录 消毒液名称75%乙醇配制批号 培养基名称培养基批号培养温度 实验日期培养时间 手指菌测试结果 （cfu/手套） 实验人员 手指菌测试时间 0min 5min 10min 15min 20min 结论 检查人 日 期 复核人 日 期 YZ63024 X00， 19/ 20 附表 12 消毒剂储存有效期确认记录 序号方法消毒剂名称工作菌液 杀灭对数平均值 KL(天) 可接受标准 3 5 7 10 1 定量 悬浮 试验 75% 乙醇 金黄色葡萄球菌 阴性对照无 菌生长； 杀灭对数 值(KL) 应 不低于 3 个 对数单位 大肠埃希菌 白色念珠菌 2 0.1%新洁尔灭 溶液 金黄色葡萄菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 3 2% 甲酚皂溶液 金黄色葡萄菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 1 表面 试验 75% 乙醇 金黄色葡萄菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 2 0.1%新洁尔灭 溶液 金黄色葡萄菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 确认结果评价： 操作人日期 复核人日期 YZ63024 X00， 20/ 20