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1、本实验是中山大学化学与化学工程学院创新实验与研究资金(No.24) 资助项目 155 基于碳纳米管的安培型H2O2生物传感器的研究 麦智彬邹小勇 * ( 中山大学化学与化学工程学院，广州：510275) 摘要利用阳离子染料硫堇 （ Thionine, Thi ） 作为介体同时结合多壁碳纳米管（ MWNTs ） 、 壳聚糖（ Chitosan, CHIT ） ， 辣根过氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP ）的混合包埋物制作H2O2生物传感器。通过循环伏安法、计时电流 法对传感器的性能进行研究。结果表明所得传感器具有明显的增敏效应，线性范围为30mol/L5.5mmol
2、/L ，相 关系数为0.9995。在 S/N=3 的情况下，检出限为19mol/L。所得的传感器具有良好的稳定性及工作寿命。 关键词碳纳米管硫堇壳聚糖辣根过氧化酶过氧化氢 1引言 H2O2是过氧化酶参与的酶促反应产物，它的测定对于食品、药物和环境分析等具有重要意义。迄今为止， H2O2的测定方法包括光谱法 1 ，化学荧光分析法 2 ，滴定分析法 3 以及电化学分析法 4 。其中电化学分析法由于 具有较高的灵敏度，良好的线性范围，快速而稳定的响应信号而被广泛研究。 碳纳米管（ CNTs）发现于 1991 年 5 ，其独特的理化性质使之广泛地应用在生物传感器的研究之中。目前国 内外已有多篇有关CN
3、Ts 生物传感器的综述 6-7 。本文首次利用Thi 作为介体结合CHIT 、MWNTs和 HRP 的混 合包埋物制作H2O2传感器，利用循环伏安法（CV） ，计时电流法（I-t ）对传感器的工作机理、性能及寿命进行 了研究。 2实验部分 2.1试剂 HRP 购自国药集团化学试剂有限公司(RZ250 units/mg) 。CHIT 购自上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度 为 99%。H2O2（30% w/v 溶液）购自广州化学试剂厂。羧基化的MWNTs 购自深圳纳米港公司，纯度大于90， 直接使用。其它试剂均为分析纯。0.1mmol/L 的 Thi 溶液用 0.05mol/L pH 6.5 的
4、 PBS 溶液配制。 1%的 CHIT 溶 液用醋酸溶液配制。其余溶液用超纯水配制。 2.2仪器 CHI660A 型电化学工作站（上海辰华仪器公司）以及三电极系统：H2O2传感器为工作电极，铂丝为辅助电 极， Ag/AgCl为参比电极。 扫描电镜 （SEM ） 照片采自日本电子株式会社场发射扫描电子显微镜（型号： JSM-6330F ） ， 透射电镜 （TEM ） 照片采自日本电子株式会社透射电子显微镜（型号：JEM-2010HR ） 。红外光谱采用德国Bruker 公司傅里叶变换 红外光谱 -红外显微镜联用仪（型号：EQUINOX 55 ）制作。 156 2.3传感器的制作 玻碳电极（ GC
5、, =4mm）分别在载有1.0、 0.3、 0.05 m 的 A l2O3颗粒的绒毛垫上抛光处理后，用超纯水冲 洗干净，依次在1:1 HNO3、无水乙醇及超纯水中超声处理各两分钟，自然晾干后备用。 5%的 Nafion 用无水乙醇稀释至0.5%。5 L 0.5% 的 Nafion 滴加在电极表面，自然晾干，得Nafion 修饰电极 （ GC/Naf） 。GC/Naf 在 0.1mmol/L 的 Thi 水溶液中浸泡10min ，在此过程中， Nafion 和 Thi 通过静电作用充分结 合。静电吸附Thi 后的电极用二次水彻底洗去弱吸附的Thi 分子，晾干后得传感器底层（GC/Naf/Thi
6、） 。 1mg MWNTs在 1%的 CHIT 中超声处理15min 后得到1mg/mL 的 MWNTs-CHIT 。10 L MWNTs-CHIT与 5 L10mg/mLHRP均 匀 混 合 后， 取 其中8 L覆 盖 在 传感 器 底 层 上，4 下 干燥24h ，得H2O2传 感器 （ GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT） ，整个传感器的制作过程如图1 所示。 图 1 H 2O2传感器制作流程图 2.4实验方法 所有实验在0.05 mol/L pH6.5 PBS中进行。电解池中加入0.6mL 底液，然后加入不同体积H2O2储备液进行 电化学测定。循环伏安曲线在溶液静止状态
7、下测定，计时电流法实验在搅拌状态下进行。 3结果与讨论 3.1MWNTs 的物理表征 MWNTs 在 1% CHIT 中的分散状况如图2C 所示。分别考察MWNTs 在水及 1% CHIT 中分散30 天后的状 况，研究发现MWNTs在水中已出现明显的聚沉现象，而在1% CHIT 中仍分散良好。因此与水相比，1% CHIT 对 MWNTs 具有更稳定的分散能力。 从 MWNTs 的 SEM（图 2A ） 可以很好地观察到MWNTs 的管状结构。 而由 TEM（图 2B）可判断出MWNTs 的直径范围为820nm。 同时利用FT-IR 表征了MWNTs 功能化前后表面官能团（图2D）的状况。结果
8、表明功能化后的MWNTs 在 1710 和 1568cm -1 有明显的吸收峰。另外3440cm -1 和 1185cm-1的吸收峰分别归属于-OH 和 C-OH 的弯曲吸收振 动。由这些吸收峰可以推知，MW NTs 的表面被部分氧化为羧基和羟基。 157 (A) (B) (C) 4000300020001000 b a C - OH - C OO - - C O OH - OH 3440 1185 1568 1710 T r a n s m i t t a n c e / % W a v e n u m b e r/c m -1 (D) 图 2 MWNTs 的物理表征 （A 为 MWNT s
9、的 SEM 图、B 为 MWNT s的 TEM 图、C为 MWNT s分别在水和1%CHIT中分散 30天后分散效果对比、D为羧基化前后MWNTs 的 IR 图） 3.2传感器的电化学性质 利用循环伏安法研究了传感器的电化学性质如图3 所示。传感器在底液里（图3c）有一对准可逆峰 （Ea=-0.137V, Ipa-1.668 A; Ec-0.212V , , Ipc1.668 A; E=75mV ） ，该峰归属于Thi 在电极表面的氧化还原。 与 GC/Naf/Thi （图 3a）相比（ Ea=-0.146V, Ipa-8.672 A; Ec-0.231V , , Ipc6.203 A; E=
10、85mV ） ，传感器的氧化 及还原峰电流均有所下降，而可逆性增加。这是由于包埋MWNTs-CHIT-HRP后导致传感器的阻抗增大，但 MWNTs特殊的空间效应和催化能力又促进了传感器内部介体的电子传递，使Thi 的氧化还原电对的可逆性增 加。在 21mmol/LH2O2的存在下（图3b） ，Thi 的还原峰电流明显地增加。H2O2与生物传感器的反应机理如下所 示： H2O2+HRP H2O+HRP-I (1) HRP-I+LTHHRP -II+TH (2) HRP-II + TH HRP + TH + (3) TH +H+2eLTH 2 (4) HRP 首先将 H2O2还原为H2O，自身氧化
11、为HRP-I （ 1） 。HRP-I 被白硫堇（ LTH ）进一步氧化成HRP-II （2） ，之 后在硫堇自由基（TH ）的存在下HRP-II 被还原为HRP，失去电子后的TH 转变成 TH +，在酸性条件下得到电子 重新还原LTH2，所以传感器在H2O2的存在下还原峰电流增加。 158 0.10.0-0.1-0.2-0.3-0.4 -15 -10 -5 0 5 10 15 C u r r n e t / A Potential / V(vs.Ag/AgCl) b: biosensor+21mmol/LH2O2 c: biosensor+blank a: GC/Nafion/Thi+blan
12、k a b c 图 3 生物传感器对21mmol/L H2O2响应的循环伏安图 3.3实验条件的优化 通过一系列实验对传感器的实验条件进行了优化，结果如表1 所示。在以后的定量分析中，均采用表1 的 选择值作为实验条件。 表 1 实验条件参数优化表 参数测量范围选择值 静电吸附时间 /min 515 10 扫描速率 /(mV/s) 20100 50 工作电位 /V 0-0.40 -0.22 pH 5.98.0 6.5 HRP 用量 /units 19 6 3.4传感器工作机理探讨及在定量分析中的应用 3.4.1 传感器工作机理探讨 为 了 探 讨MWNTs、 HRP对 传 感 器 响 应 信
13、号 的 贡 献 ， 利 用 计 时 电 流 法 分 别 考 察 了 (A)GC/Naf/Thi/MWNTs-HRP-CHIT；(B)GC/Naf/Thi/HRP-CHIT；(C)GC/MWNTs-CHIT对 0.5mmol/L H2O2的响应 情况，结果如图4 所示。由图可知，IAIB+IC，传感器具有明显的增敏效应。增敏现象可以从几方面来考虑： 一方面 HRP 可以有效地吸附在MWNTs 管壁上 8 ，由于 MWNTs 具有较大的比表面积，电极表面的活性位点增 多；另一方面MWNTs也可以利用其独特的三维网络结构深入HRP 的活性中心 9 ，促进酶与电极的电子传递， 减少HRP外层多肽的阻抗
14、；另外，MWNTs较大的比表面积也可以对H2O2起到富集作用；同时，注意到 GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对 H2O2仍有部分响应（图5） ，MWNTs 对 H2O2具有催化作用，促使H2O2还原的过 电位下降。总的来说，传感器的增敏作用受到以上几个因素的协同效应的影响，涉及到MWNTs在传感器中的 空间效应及电子效应。 159 250300350400450500 0 1 2 3 4 5 6 7 C u r r e n t / A Time / second A:GC/Naf/Thi/HRP-MWNTs-CHIT B:GC/Naf/Thi/HRP-CHIT C:GC/MWNTs-
15、CHIT 300400500600 0.700 0.725 0.750 0.775 0.800 0.825 0.850 C u r r e n t / A Time / second 图 4 传感器不同组分对0.5mmol/L H2O2 图 5 GC/Naf/Thi/MWNTs-CHIT对 响应信号的贡献0.5mmol/L H2O2的响应 3.4.2 传感器的工作曲线及米氏常数 利用计时电流法考察了传感器对H2O2的响应情况（图6） 。结果表明，传感器的对H2O2具有快速的响应， 信号达到95%所需的时间小于6s，且在H2O2浓度为30 mol/L5.5mmol/L的范围内呈线性响应，方程为
16、Current /A= 4.272 10-8+ 7.04010-4C/(mol/L) ，相关系数为0.9995。同时，根据Lineweaver-Burk方程 10 ： 1/Iss1/Imax+KM app/I maxC （式中 Iss为加入底物后的电流强度，C 为底物浓度，Imax为固定底物浓度后的最大电流，KM app 为米氏常数。 ）用 双倒数法求得米氏常数为1.93mmol/L（图 7） 。从图形意义上来说，米氏常数为检测上限和检测下限的中点位置， 而本文所求得的米氏常数与该理论非常吻合，说明在该浓度范围内，传感器的反应属于一级反应动力学过程。 传感器对0.1mmol/L 的 H2O2分
17、别进行了8次测量，求得R.S.D=5.8% ， D.L. = 19 mol/L 。 200400600800 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 0123456 0 1 2 3 4 C u r r e n t / A Concentration / (mmol / L) C u r r e n t / A Time / second 0.00.51.01.52.02.53.03.5 0 5 10 15 20 25 30 35 1 / I / 1 0 6A - 1 1/C / 104L mol-1 . 图 6 传感器对 H2O2的标准曲线图 7 传感器的米氏常数
18、曲线 （I-t 曲线由连续加入浓度为0.1mmol/LH2O2制作） 3.4.3 传感器的稳定性和寿命 传感器连续考察了7 天，每天用0.1mmol/L H2O2分别测量6 次，结果表明当传感器进入第四天后，电流下 降了 6.3%，但此后电流基本上稳定在75nA 左右。说明传感器具有良好的稳定性和较长的寿命。 160 4结论 利用 MWNTs-CHIT包埋 HRP 制作了以Thi 为介体的H2O2的生物传感器。实验结果表明，MWNTs 由于其 特殊的空间结构，电子性质，使其在传感器中起到三维网络导电骨架的作用，与一般的CHIT 包埋 HRP 传感器 相比具有明显的增敏效应。用这种方法制作的传感
19、器具有良好的生物活性、稳定性及重现性。在这个结果之上 有望开发基于氧化酶-HRP 双酶体系的生物传感器。 参考文献 1.Higashi N., Yokota H., Hiraki S., et al. Direct Determination of Peracetic Acid, Hydrogen Peroxide, and Acetic Acid in Disinfectant Solutions by Far-Ultraviolet Absorption Spectroscopy. Anal. Chem., 2005, 77(7): 2272-2277. 2.Lu J. Z., Lau C
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