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1、教学准备 1. 教学目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 2. 教学重点 /难点 教学重点： 凝胶色谱法的原理和方法 教学难点： 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 （一）引入新课 蛋白质的知识回忆： 含量：占细胞干重的50以上，是细胞中含量最多的有机化合物。 2、组成元素： C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸 4、分子结构： 氨基酸 多肽 蛋白质 肽键： CONH 5、相对分子质量：高分子化合物 蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究 有助于人
2、们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取 蛋白质呢？ （二）蛋白质分子的差异性 1基础知识 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等 千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 11 凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：（见课件图）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程： 混合物上柱 洗脱 大分子流动快、小分子流动慢收集大分子 收集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差
3、速流动。 12 缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3NaHCO3 ，HCNaC， NaH2PO4/Na2HPO4 等），调节酸和盐的用量，可配制不同 pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH 的干扰而保持pH 稳定。 13 凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力 大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 思考阅读投影补充材料后，填写下表： （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。 （3）分离过程：在一定pH 下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多
4、的 SDS，形成 “ 蛋白质 SDS 复合物 ” ，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 例：聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS） 聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙 烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N -亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用 下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 2.原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的 大小等因素。（SDS 的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。 3. SDS 作用机理 : SDS 能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS 的作用下会解 聚成单
5、条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS 复合物， SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不 同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 （三）、血红蛋白的提取和分离实验设计 2.1 蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。 2.2 选择实验材料 （1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，
6、血红蛋白含量高。 （2）请阅读投影资料，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由血浆和血细胞两部分组成。 血细胞中红细胞细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是血红蛋白。 该化合物是由两个 肽链、两个 肽链和四个亚铁红素基团构成的，其中每个亚基 中都含有一个能与O2 和 CO2 结合的亚铁红素基团。 2.3 从红细胞中分离出血红蛋白的过程为： 洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？ 除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。 红细胞的洗涤过程为：血液柠檬酸钠低速短时离心 吸出上层血浆红细胞 5 倍体积生理盐水 缓慢搅拌 10min 低
7、速短时离心 吸出上清液 反复洗涤直至上清液无 黄色 思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？ 加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。 补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞 膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且 还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同， 科学家采取了离心分离的方法： 红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min 10m
8、in ） 滤纸过滤除去脂质分液漏 斗分离出血红蛋白 2.4 如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。 透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半 透膜。 在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7 的 磷酸缓冲液中。 思考：为何使用pH7 的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。 总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其 他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究 蛋白质提取和分离的第二个步骤 粗分离
9、（凝胶色谱操作）。 2.5 凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。 根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。 橡皮塞 2 个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。 色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞 安装色谱柱 下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材： 色谱柱的装填过程。 样品加入和洗脱。其基本过程是： 调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面 洗脱 收集分装蛋白质 至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项： （1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 （2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和
10、气泡 （3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 （4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 （四）、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能 是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞 和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶
11、柱垂直的日光灯， 检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000 或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性 能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装 柱。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴 定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的 处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对 分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯
12、酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 4、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况， 并据此判断分离效果？ 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色 区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分 离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 课堂小结 当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和 必要性，进而说明本节课的目的，以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些 基本技术，尝试从血液中提取和分离血红蛋白，了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的 基本原理，为今后学习这些技术带下基础。 板书 专题五第三节血红蛋白质的提取和分离 一、蛋白质分子的差异性 1凝胶色谱法 2缓冲溶液 3凝胶电泳法 二、血红蛋白的提取和分离实验设计 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 三、实验结果分析与评价