生物安全管理体系文件.pdf

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1、实验室生物安全管理制度 目的：确保实验人员生物安全， 环境不受污染， 样品质量不受影响特制定该 管理制度。 一、人员准入条件 1、实验室人员、辅助人员和外来人员必须具备相应的专业技能、受过相关的实 验室生物安全培训、 了解实验室潜在的生物危害和特殊要求，经负责人审批后方 可进入相应的实验室工作。 2、未成年人、孕妇和有免疫缺陷的人员不得进入实验室，处于易受感染状态或 感染后果严重的额人员也不得进入实验室。 3、实验室人员必须在身体状况良好、穿戴好防护服（白大衣）的情况下，方能 进入实验室的污染区域工作。 但当身体出现较大的开放性损伤、处于较重的疾病 感染状态或呈重度疲劳状态时不得进入。 4、外

2、来参观人员需经科室负责人同意并在相关人员陪同下方可进入实验室。 二、生物安全日常管理： ( 一) 生物安全行为规范 1 进入实验室前要摘除首饰，修剪指甲，以免刺破手套。长发应束在脑后，禁 止在实验室内穿露脚趾的鞋。 不得佩戴有可能被卷入机器或可随人传染性物质的 饰物。 2在实验室里工作时， 要始终穿着实验服， 实验室外禁止穿防护服 （白大衣）。 大白衣应定期清洗、更换，清洗时应使用具有杀菌消毒的洗液或其他相应方法。 3、操作感染性物质、腐蚀性或毒性物质时须在通风橱中进行，并佩戴相关的安 全防护用品，如安全镜、面罩或护目镜。皮肤受损时应以防水敷料覆盖。 4、当有必要保护眼睛和面部以防实验对象喷溅

3、、或紫外线辐射时，必须要配戴 护目镜，面罩（带护目镜的面罩）或其它防护用品。 5、实验室工作区不允许吃、喝、化妆和操作隐形眼镜，禁止在实验室工作区内 的任何地方贮存人用食品及饮料。 6、实验室防护服不应和日常服饰放在同一柜子。个人物品、服装和化妆品不应 放在有规定禁放的和可能发生污染的区域。 7、不得涉及呼吸道传播疾病样品室，要佩戴符合要求的防护口罩。 ( 二) 操作准则 1、所有样本、培养物均可能有传染性，操作时均应带手套。在认为手套已被污 染时应脱掉手套，马上洗净双手，再换一双新手套。 2、当实验过程可能涉及到直接或意外接触到血液、有传染性的材料或被感染的 动物时， 必须要戴上合适的手套，

4、 脱手套后必须洗手。在实际或可能接触了血液、 体液或其他污染材料后，即使戴有手套也应立即洗手。 3、不得用戴手套的手触摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮肤。不得带手 套离开实验室或在实验室来回走动。 4、严格禁止用嘴操作实验器材，包括吸液、吹酒精灯等。实验材料禁止放入嘴 里。禁止舔标签。 5、尽量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破损的玻 璃不能直接用手直接操作，必须用机械方法清除，如刷子、夹子、镊子等。破裂 的玻璃器具和比例碎片应丢弃在有专门标记的、单独的，不易刺破的容器里。 6、所有的实验步骤都应尽可能使气溶胶或气雾的形成控制在最小程度。任何使 形成气溶胶的危险性上升

5、的操作都必须在生物安全柜里进行。有害气溶胶不得直 接排放。 7、应尽可能减少使用利器和尽量使用替代品。包括针头、玻璃、一次性手术刀 在内的利器， 应在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器应在内容物达到三分 之二前置换。 8、所有溅出事件、意外事故和明显或潜在的暴露于感染性材料，都必须向实验 室负责人报告。此类事故的书面材料应存档。 9、所有弃置的实验室生物样本、培养物和被污染的废弃物应被假定有传染性， 在从实验室中取走之前，应以安全方式处理和处置，使其达到生物学安全。 10、实验室应保持整洁、干净，当潜在的危险物溅出或一天的工作结束后，所有 操作台面、离心机、加样枪、试管架必须擦拭、消毒。 1

6、1、每日工作完毕，最后一个离开实验室的人员需关好水、电、门、窗。 ( 三) 监督与检查 1、涉及病原体的科室负责人要经常对各项实验的生物安全性进行检查和监督。 2、各实验项目主管人员要定期对所开展的实验工作进行监督与检查，及时发现 并报告安全隐患事件。 三、常见实验室废弃品处理 实验室废弃品按物理类型而言可分为固体废弃品、液体废弃品及气体废 弃品，就危害类型而验分为化学毒性废品和病原性废品，由于废弃物品具有潜在 的致病性、伤害性，如不妥善处理会造成很大的人身危害、 环境污染和社会危害。 根据国家危险废物品名录、 医疗废物管理条例、卫生部和国家环境保护 总局制定的医疗废物分类目录有关规定的要求，

7、对实验室废弃物进行分类， 主要包括感染性废弃物、 病理性废弃物、 损伤性废弃物、 化学性和放射性废弃物 等。 分类特征常见废弃物名称处理程序 感染性废 弃物 携带病原微生 物具有引发感 染性疾病传播 危险的废弃物 包括被感染性实验材料等污 染的物品与器材，如手套、 口 罩与白大衣、 试管、 平皿、 吸 管等实验器材以及废弃的感 染性实验标本、 培养液、 培养 基等。 放入盛有适宜消毒液的不易碎 裂的容器中浸泡。注意消毒剂 的种类、浓度及浸泡时间，浸 泡后放入合适的容器内进行高 压灭菌或焚烧处理 病理性废 弃物 实验动物尸体 等废弃物 包括废弃的质粒、细胞、单克 隆课题、 临床、组织样本及实 验

8、动物组织、尸体等。 集中与实验室指定位置，严格 与感染性生物材料区分，高压 灭菌后废弃。盛放容器宜浸泡 消毒。 损伤性废 弃物 能刺伤或割伤 人体的锐器等 废弃物 包括医用枕头、 缝合针、 手术 刀及破碎玻璃等 高压灭菌或焚烧处理，盛放锐 器的一次性容器不易刺破，不 宜将容器装得过满（小于四分 之三），如感染性废弃物进行 高压灭菌及焚烧处理 化学性、 放射性废 弃物 具毒性、腐蚀 性、易燃易爆 的化学性废弃 物及放射性废 弃物 包括强酸、强碱等有毒有害的 化学性废弃物一级放射性废 弃物等。 强酸强碱等化学性物品须经中 和消除腐蚀行后方可废弃，其 他物品经稀释对环境与人体无 毒后可废弃。含有毒、

9、有害化 学物品的实验材料在使用后应 置于带明显危险标志的容器内 送至指定地点统一处理。 四、支持文件 1. 中华人民共和国传染病防治法 2. 病原微生物实验室生物安全管理条例 3. 实验室生物安全通用要求(改变 9489-2004) 4. 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS233-2003 ） 5. 实验室生物安全守则（WHO, 第三版， 2004年） 6. 病原微生物实验室生物安全（生物安全培训卫生部规划教材，第2 版） 7. 医疗废弃物管理条例 8. 实验室生物安全 病毒制备质量管理体系 目录 原始病毒的扩增 大量病毒制备的灭菌操作 病毒制备程序 痘苗病毒的收获和纯化 腺病毒的收

10、获和纯化 病毒滴度测定 病毒质控 细菌污染及检测 支原体污染及检测 基因检测 病毒活性检测 体外细胞杀伤复制能力检测 原始病毒的扩增 -病毒种子制备 一般原始病毒的扩增用优质 （无污染 -须通过细菌和支原体检测） CV1 / JH293 细胞， 每种原始病毒的扩增需要在一个细胞融合度80%（细胞处于对数生长期， 活性好，感染效率高）的T175培养瓶中进行： 1. 细胞计数： 培养箱中取出细胞，镜下观察，将状态良好，融合度80%的细胞移至 超净工作台。 去除细胞培养瓶中的旧培养基。 PBS冲洗：从无细胞一侧加入适量（约10ml）PBS冲洗细胞后弃上清， 酌情反复 12次，以达到彻底洗掉培养基中的

11、血清成份。 消化细胞：加入1ml 0.25%胰酶消化液，使之铺满细胞表面，放入培养 箱（37）作用数分钟后，把培养瓶放置显微镜下观察，发现细胞回缩变圆，细 胞间隙增大； 或肉眼观察，见到瓶底出现细针孔间隙倾斜瓶子出现流沙样现象即 可终止消化。 终止消化：轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，从无细胞面侧加入适量完全 培养基（含血清的 DMEM）终止消化，并用移液管吸吹数次以打散细胞团块，混 合均匀，使之成为单细胞混合液。 计数板准备：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。 加样：用移液管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液（可酌情稀释）， 在计数板上盖玻片一侧靠虹吸现象加入微量（约 10ul）细

12、胞悬液， 使之充满玻璃 槽，不可产生气泡， 不可溢出外侧亦不可溢入对侧玻璃槽。如产生上述情况需对 计数板冲洗拭干重新加样。 计数：静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移，将细胞计 数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后， 再转换高倍镜 观察并计数。 由于活细胞的遮光率和液体的折光率相近，观察时应减弱光照的强 度。 计数时计数区是由16 个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下 的 4 个大方格的细胞数，为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉 降在格 线上的细胞的统计应有统一的规定计数原则：计上不计下， 计左不计右！ 如细胞位于 大方格的双

13、线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上 线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。 按下式计算： 细胞悬液细胞数/ml 4 个大格细胞总数/4 10 000稀释倍数 2.感染种子：取平行对照培养优质融合度80%的细胞，弃旧培养基并 加入含病毒种子的30mL 感染培养基（ DMEM+10% FBS+1pfu/cell ） ，轻轻晃动培 养瓶，使病毒在培养基中充分混匀。 3. 收集种子：标记病毒种类和培养日期， 在 37 oC， 5% CO 2条件下培养。 定时（24h/48h/60h/72h) 检查 CPE( 细胞变圆变亮脱壁，漂浮

14、)，待 80%细胞出现 CPE ，即可收集。将含病毒细胞悬液加入50mL离心管中，标记病毒种类和日期， 冻存于 -80备用，并测定病毒滴度，以备感染病毒使用。 大量病毒制备的灭菌准备工作 1. 用过的 500mL离心瓶泡入酸液中，过夜，冲洗干净，烤干，高温灭 菌。 2. 准备足量 T175培养瓶必须泡入酸液中， 过夜， 用水充分冲洗，干燥， 灭菌包布包被灭菌。 3. 培养细胞所用的移液管，离心管必须泡入酸液中，过夜，用冲洗干 净，干燥，灭菌包布包被灭菌。 4. 离心管泡入酸液中， 过夜后再处理， 针头直接灭菌， 在移除针头钱， 确保离心管实在一个大烧杯上，这样漏液不会污染操作台。 5. 研磨器

15、泡入酸液中，过夜，用水充分冲洗，干燥，灭菌包布包被灭 菌。 6. Beckman 超高速离心机及特制转子和离心管准备。 7. V型槽， 96 孔板，排枪准备。 病毒制备程序 一细胞准备： 1. 建立细胞种子库：复苏细胞（CV1用于痘苗病毒病毒； JH293用于腺病毒 病毒）分别于与第3/5/7/14天取上清两份，一份用于支原体检测，另一份加至 培养基中放于培养箱中定时镜下观测，用于细菌检测， 保证细胞质量。 待细胞生 长细胞融合度 80%消化传代扩增并冻存足量细胞种子于液氮中，冻存管上须准 确标记所冻细胞名字，代数，冻存人以及冻存日期等相关信息。（慢冻速溶） 2. 细胞扩增培养： 当 1瓶 T

16、175培养瓶中细胞生长融合度80%时， 将培养瓶中培养基吸出， 各加入 1ml 胰酶消化，37 ，2-3 分钟；加入适量（5ml）完全培养基终止消化， 全部转移至 50ML 离心管中，总量为6ml。分别抽取 2ml 此混合液加入含18ml 完全培养基（含 10%血清）的 T175 培养瓶中共三瓶继续培养（1 传 3） ，原瓶继 续培养待下一次传代。 继而同上方法扩增至12 瓶 T175培养瓶培养（ 1 传 4） 细胞生长融合度 80%时同上方法扩增至36 瓶为一批（ 1 传 3） ，其中 1 瓶 T175培养瓶中细胞作 为平行对照， 放入 37 CO 2孵育箱中培养 48-72 小时。平行对照

17、培养瓶同时放入 孵育箱，直至融合度 80%。 二病毒感染： 观察平行对照培养瓶中细胞生长率80%时，准备进行病毒感染；同时 也观察其它所有细胞，对比细胞增殖速度是否一致。 取平行对照瓶细胞计数，并计算需要感染病毒量（1pfu/cell)。 -80冰箱中取出测定过病毒滴度的病毒种子，按计算好的病毒量配制 1080ml（30ml /瓶 36 瓶）含 2%血清的 DMEM 培养基。放入 37二氧化碳孵育 箱中培养 48-72 小时，或直到 90%细胞都出现 CPE 。 痘苗病毒的收获和纯化 三病毒收获： 1)从 37二氧化碳孵育箱中取出达到收获标准的36 瓶 T175培养瓶，轻轻晃 动培养瓶，少量贴

18、壁细胞即刻脱落。而后移至超净工作台用移液管轻轻吹打 未脱落细胞，并将含病毒混合液分装（收集）到灭菌的500ml 离心瓶中。 2)移至高速离心机中配平， 3500rpm，15min，4离心。 3)弃上清，移液管取 10ml 冷 PBS加至离心瓶中重悬混匀，将液体转入50ml 离 心管中。 4)方法同上，用冷PBS反复清洗两次500ml 离心瓶，并将液体转致同一50ml 离心管中。 5)移至高速离心机中配平， 3500rpm，15min，4离心。 6)弃上清， 4取 7ml 冷 VV-Buffer 重悬混匀，并冻存于 -80待纯化。 四病毒纯化： 1)将待纯化病毒溶液在液氮与37水浴锅中反复冻融三

19、次， 使包含于细胞内的 病毒颗粒完全释放。 2)将完全融化的病毒液移至超净工作台，加入灭菌的研磨器中匀速缓慢反复研 磨 60 次。 3)将研磨好的病毒液转入50ml 离心管中配平， 1200rpm，5min ，4离心。 4)吸 取 上清 于另一50ml 离 心 管 中， 取 3ml VV-Buffer重 悬沉 淀 ， 2ml VV-Buffer 冲洗离心管，加至同一 50ml 离心管，将混合液再次加入研磨器中 反复研磨 60 次。 5)将研磨好的病毒液转入50ml 离心管中配平， 1200rpm，5min ，4离心。 6)取上清于一新的无菌离心管中， 移至超声仪中超声 （破碎）两次，每次 20

20、s。 7)在 SW41Beck man 离心机专用离心管中加入7ml 36%蔗糖（ w/v)10MM Tris-Hcl （PH 9.0 ） 配制 ， 再沿管壁缓慢加入3.5ml 研磨超声处理过的病毒液， 使之形成分层。 8)用 VV-Buffer 称重配平，误差须小于0.5g（误差越小越好），移至 Beck man 离心机中（ 14 / 25 / 36 转子对应配平）13500rpm/32900xg，80min，4。 9)待离心结束，将转子移至超静工作台打开，用镊子小心拿掉转子盖子，切勿 污染，再用无菌镊小心取出离心管， 去除上清，取 6mlVV-Buffer 重悬沉淀。 10) 梯度蔗糖：

21、底层为 4ml 40% 蔗糖溶液(用 10mM Tris-HCL pH9.0配制)，依次向上分别为 4ml 35% 蔗糖溶液； 4ml 30% 蔗糖溶液和 4ml 25% 蔗糖溶液（最上层）。每个病 毒样本制备至少两份梯度，分别小心在上层加入病毒悬液，使之形成分层。 11) 用 10mM Tris-Hcl （PH 9.0）称重配平，误差须小于0.5g（误差越小越好），移 至 Beck man离心机中 （14 / 25 / 36转子对应配平）20000rpm， 60min， 4。 12) 待离心结束，将转子移至超静工作台打开，用镊子小心拿掉转子盖子，切勿 污染，再用无菌镊小心取出离心管， 去除上

22、清，取 2mlVV-Buffer 重悬沉淀。 13) 病毒分装与储存：取灭菌EP管，取少量病毒液进行滴度测定，其余根据实 验需要按 20ul / 50ul /100ul / 支并按规定明确标记病毒名称，日期等信息后， 冰上分装冻存于 -80冰箱病毒库。 腺病毒的收获和纯化 三. 病毒收获： 7)从 37二氧化碳孵育箱中取出达到收获标准的36 瓶 T175培养瓶，轻轻晃 动培养瓶，少量贴壁细胞即刻脱落。而后移至超净工作台用移液管轻轻吹打 未脱落细胞，并将含病毒混合液分装（收集）到灭菌的500ml 离心瓶中。 8)移至高速离心机中， 2000rpm，10min，4离心。 9)弃上清，移液管取 10

23、ml 冷 PBS加至离心瓶中重悬混匀，将液体转入50ml 离 心管中。 10) 方法同上，分别用冷PBS5ml反复清洗两次 500ml 离心瓶，并将液体转致同 一 50ml 离心管中。 11) 移至高速离心机中配平， 1000rpm，10min，4离心。 12) 弃上清， 4取 12ml 冷的 10mM Tris.HCI(Ph8.0) 重悬混匀，并冻存于 -80待 纯化。 四病毒纯化： 1. 将制备的含病毒溶液在液氮和37水浴中反复冻融三次。 2. 将该溶液 37水浴融化，转入50ml 离心管中，室温， 6000 rpm 离心 10 分钟。保留上清，冻存于 -80冰箱或立即进行CsCI梯度离心

24、。 3. 将 6 只超高速离心用离心管中分别先加入10ml1.25g/mlCsCI. 再小心轻轻加 入 7.6ml1.4g/mlCsCL, 然后将病毒混合液平均轻轻加入CsCI液面上。 4. 称重，用灭菌的 Tris.HCI(Ph8.0) 配平，误差 0.1g。 5. 将离心管放入 Beckman SW32转子中， 放入 LE-80K超速离心机中（14 / 25 / 36 转子对应配平）离心， 25000rpm，15，2 小时。 6. 小心取出离心管放于无菌操作台中，将离心管夹于管夹上，用19号针头 刺入离心管，小心抽取夹层膜状物（病毒条带呈乳白色），尽量多抽，将 所抽出液体转入 50ml 离

25、心管中。 7. 将 50ml 离 心 管 中 含病 毒 液 体顺 液 面 轻轻 平 均 分 配 加 入 至 已 加 入 3ML1.35g/mlCsCI溶液的 5ml 超高速离心用离心管中。 8. 用 Tris.HCI(Ph8.0) 称重配平，误差 0.1g。 9. 将离心管放入 Beckman SW41转子中， 放入 LE-80K超速离心机中（14 / 25 / 36 转子对应配平）离心， 40000rpm，15，15 小时。 10. 小心取出离心管放于无菌操作台中，将离心管夹于管夹上，用19 号针头 刺入离心管，小心抽取夹层膜状物（病毒条带），尽量少抽，将所抽出液 体转入 50ml 离心管中

26、。 11. 将液体注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析24 小时。 12. 病毒分装与储存：透析结束后，将透析袋转至无菌工作台中，取少量病毒 液进行滴度测定， 其余病毒液根据实验需要按20ul / 50ul /100ul / 支并按规 定明确标记病毒名称，日期等信息后，冰上分装储存于-80冰箱病毒库。 病毒滴度测定（ TCID50 ） 1培养 CV-1（VV）或 JH293 （AD）细胞。 2当培养瓶中细胞生长率80%时，将各培养瓶中培养基吸出， 各加入少量 胰酶消化， 37，2-3 分钟；再各加入 5mL10% FBS 的 DMEM 培养基混匀，细胞 计数。 3根据细胞计数结果将细胞铺入

27、96 孔板，每孔 3 103细胞于 200 微升 10% FBS的 DMEM，过夜。 4第二天早晨，按比例稀释病毒，一般是1：105稀释： 第一排用排枪加入20 微升，轻轻混匀 5 次，去掉枪头； 从第一排吸取 22 微升加入到的第二排，轻轻混匀5 次; 同样从第二排吸取22 微升加入到第三排，轻轻混匀5 次； 依次到倒数第二排，最后一排做对照。 5. 从感染病毒起，第810 天观察。先观察最后一排细胞状态，长满时， 计每排 CPE的数值。计算病毒滴度。 10ul 病毒原液990ul DMEM 3ul 混合液2997ul DMEM 20ul 排枪加至96 孔板第一排 6. 代入以下表格计算病毒

28、滴度： DilutionsNo. infected w ells No. un- infected w ells Total no. infected Total no. un- infected % total infected Above 0.5% above 0.5% below 0.5log dilut above 5 1.00E-051206901TRUE000 1.00E-061205701TRUE000 1.00E-071204501TRUE000 1.00E-081113310.9705882TRUE000 1.00E-091022230.88TRUE000 1.00E-105

29、712100.5454545TRUE0.54545450-10 1.00E-11757150.3181818FALSE00.31818180 # of Wells12 mls/well0.020.50.54545450.3181818-10 Prop. Dist.0.2 Log TCID50 -10.2 TCID506.3096E-11 1/TCID501.5849E+10 TCID50/ml7.9245E+11 pfu/ml5.4679E+11 cell number90000 volume 2 pfu/cell 12150848 病毒质控 一、细菌污染及检测； 二、支原体污染及检测； 三、

30、基因检测； 四、病毒活性检测； 五、体外细胞杀伤复制能力检测。 一、细菌污染及检测： 1.1 背景介绍： 细菌是一种元和细胞微生物，其大小以微米计。 常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄菌等 比较常见。 纯化后的病毒有细菌污染时并不容易发现。所以，做病毒的细菌质控 非常必要。 1.2 实验步骤： 当做细菌检测时，可以取10ul 已经纯化好的病毒加入无抗生素4ml 的培养基 （目前实验室所用的是LB培养基）试管中，将试管置于37，1800rpm 的摇床 上摇过夜（ 12-16h）,如果有细菌污染， 16h 内就可获得阳性结果。 1.3 结果判读： 多数情况下当受到细菌

31、污染时， 培养基短时间内颜色变黄， 产生大量酸性物质， 出现明显混浊现象， 此时的培养基稍加振荡就会有混浊物悬起。在倒置显微镜下 观察，可见培养基有大量圆球状颗粒漂浮，此种情况即可判定为阳性， 病毒受到 细菌污染。若无，则判读为阴性。 二、支原体污染及检测： 2.1 背景介绍： 支原体是一种介于细胞和病毒之间、能独立生活的最小微生物，最小的直径 0.2um,约有 1%可通过滤菌器，无细胞壁，形态呈多形性，可为圆形、丝状或梨 形。在光镜下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电 子密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。 支原体的污染是一个常见又棘手的问题。支原体污染后， 因它可与病

32、毒长期共 存，培养基一般不发生混浊，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则可能对后 期实验产生潜在影响，所以对支原体的污染必须严加防范。 支原体污染常用检测方法有相差显微镜法、DNA荧光处理法、 电镜检测法、 低 张处理地衣红染色观察、支原体PCR检测法等。实验室目前使用的是PCR检测 法。 2.2 实验步骤： （1） 实验前准备： 样本和对照准备： 样本：收集待检测病毒样本，若为病毒原液则可用5ul 原液加 495ul 细胞培 养基（确定无污染）进行100 倍稀释。 阳性对照：从医院取得支原体阳性样本，高压灭菌后（可分装50ul 一支） 做阳性对照。 阴性对照：灭菌蒸馏水。 引物的准备： Fw

33、d-1. ： ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT A Fwd-2. ： CCT AAA GGA ATT GAC GGG AAC CCG Rev. ： TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 以上引物可以检测出常见的14 种不同支原体。 按要求稀释为 50pmol/ul ，分装为 50ul/ 管， 20保存，待使用。 （2）PCR 反应： 配置全过程需在冰上操作： 1 st Round band at 720bp 按下列组分配置 PCR 反应液： 灭菌蒸馏水 up to 20ul 10*PCR Buffer 2ul Dntp(2.5mM) 1.

34、6ul MgCl2(25mM) 1.2ul Fwd-1. 1ul Rev. 1ul Taq 酶0.3ul 样本/ 对照1ul 1st 反应条件 95 x 30s 95x 30 s 56 x 30 s 35 cycles 72x 1min 72x 1min 反应大约需 1.5 小时，由此得到第一轮相应的PCR 产物，在打开 PCR 管前先离心甩一下，接着进行第二轮145bp 的 PCR 鉴定。 2 nd Round Band at 145bp 按下列组分配置 PCR 反应液： 灭菌蒸馏水 up to 20ul 10*PCR Buffer 2ul Dntp(2.5mM) 1.6ul MgCl2(2

35、5mM) 1.2ul Fwd-2. 1ul Rev. 1ul Taq 酶0.3ul 第一轮 PCR 的产物 （对应样本 / 对照）1ul 加过模板，第一轮产物可加1ul 10*loding buffer , 混匀后先放置 4冰箱。 待跑琼脂电泳胶。 MIX MIX 2 nd 反应条件（与第一轮相同） 95 x 30s 95 x 30 s 56 x 30 s 35 cycles 72 x 1min 72 x 1min 第二轮产物加 1ul 10*loding buffer ，终止反应，跑琼脂电泳胶。 （3）琼脂电泳跑胶： 配置 1%的琼脂糖凝胶即可。 首先将锥形瓶洗干净，然后根据样本量和胶的大小

36、取一定量的电泳缓冲液 （1TAE ）至锥形瓶中，再称取相应量的AGAROSE （琼脂糖）倒入锥形瓶中， 摇匀，最后放入微波炉加热， 煮胶的过程中需注意安全， 应适当摇匀，防止爆沸。 煮好的凝胶需无气泡、色泽及质地均匀。 将煮好的凝胶放入均匀冷却至50左右时，加入相应EB, 混匀， 及时将凝 胶倒入装好的干净模具中。 待凝胶完全凝固（约30min）后，垂直方向拔梳子。此时，凝胶需平整、 不漏孔，可以用于电泳检测。 胶前准备： 先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳 槽正中央。 胶孔的方向朝向负极（注意：放凝胶前，需将胶托底部的凝胶抹干净，防 止胶托在电泳槽中滑动；此时

37、，可顺便观察凝胶是否漏孔）。 再往电泳槽中倒入一定量的电泳缓冲液（1TAE ）至刚好将凝胶淹没。 （注 意保持桌面卫生，防止缓冲液洒到桌。 上样： 将两轮的产物和 loding buffe 混合后，轻甩，按照规定的顺序上样，上样 顺序应与电泳槽上的标记一致。 注意: 上样时必须确保上样顺序正确无误，样品间不混淆，点样后的空管子先放 在电泳槽旁边，用于核查； 点样时不戳孔、不外漏、不溢出； 点样时需小心枪头不要碰到凝胶，以免凝胶挪动，若凝胶已经挪动，需等 样品完全沉到底部后，再固定凝胶. 样品上完后，加阳性对照，阴性对照。 每排胶上留一孔加 Maker (D2000 bp) ,5 ul. 跑电泳

38、： 确认已经正确上样后， 双手同时盖上电泳槽盖， 接通电泳仪和电泳槽 （注 意：确认电极正确连接），设置电泳参数：电压： 100V，电流：400mA，时间： 25min； 注意确认电极、电泳参数完全正确之后，最后按star 键开始电泳。 凝胶成像： 带上 PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时的那个PE手套上（注 意：捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落，尽量把多余的EB染液甩干），将凝胶放 入凝胶成像系统中，按照“Tanon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。 （注 意：拍照时需严格区分EB污染区与非污染区， 防止 EB污染区污染电脑、 键盘及 鼠标） ，最后保存胶图信息至规定的文件夹内，命名

39、规则为：日期+姓名+工号+ 部门+电泳铜人阵考核。 注意事项1、电泳中使用的溴化乙锭 （EB ）为中度毒性、 强致癌性物质， 务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。 操作时戴上乳胶手套，必要时戴上PE手套和口罩。 三基因检测： 试验 1：BioTTT001 基因组测序试验 一、目的 检测 BioTTT001序列信息 二、试剂来源、配制及保存条件 试剂来源/品牌货号存储 BioTTT001 深圳S160324A -80 度 QIAmp DNA blood mini kit QIAGEN 51104 室温 蛋白酶 K TIANGEN 04020 4 度 三、仪器设备 仪器品牌型号 离心机Th

40、ermo IEC MICROMAX 微量分光光度计Thermo NANODROP ONE 恒温数显水浴锅晶 玻HH-S2 振荡器SCIENTIFIC INDUSTRIES VORTEX GENIX2 四、试验过程 1. 病毒基因组提取 1.1 向 200ul BioTTT001原液中加入 10ul 蛋白酶 K，混匀。 1.2 加入 200ulAL Buffer，震荡 15s混匀；轻微离心后，放入56 度水浴锅内，孵 育 10 分钟。 1.3 加入 200ul 无水乙醇，震荡 15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。 1.4 离心 8000 转 1 分钟，转移吸附柱到新2ml 离心管中。

41、1.5 加入 500ul Buffer AW1，离心 8000 转 1 分钟。 1.6 弃废液，向吸附柱中加入500ul Buffer AW2，14000 转离心 3 分钟。 1.7 弃废液，空转 1 分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml 离心管中。 1.8 向吸附柱中加入 50ul 超纯水，室温静置1 分钟，14000 转离心 1 分钟 2. 浓度测定 2.1 吸取 2ul 超纯水，滴到样品检测孔处，进行校准。 2.2 抬起测量臂，擦拭残留液体。 2.3 吸取 1ul 待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。 3. 送华大基因测序 3.1 准备总量为 2.5ug，浓度不低于 80n

42、g/ul 的样品，进行测序。 3.2 华大基因进行样品检测，并出示检测报告。 3.3 样品检测合格后，建立样品库进行测序。 3.4 数据分析。 试验 2：BioTTT001基因组酶切试验SOP 一、目的 通过酶切验证 BioTTT001的构建 二、试剂来源、配制及保存条件 试剂来源/品牌货号存储 BioTTT001 深圳S160324A -80 度 QIAmp DNA blood mini kit QIAGEN 51104 室温 蛋白酶 K TIANGEN 04020 4 度 EcoR V NEB R1095S -20 度 Buffer 3.1 NEB B7203S -20 度 琼脂糖Invi

43、trogen 75510-019 室温 DNA Marker TIANGEN 100bp 4 度 三、仪器设备 仪器品牌型号 离心机Thermo IEC MICROMAX 微量分光光度计Thermo NANODROP ONE 恒温数显水浴锅晶 玻HH-S2 振荡器SCIENTIFIC INDUSTRIES VORTEX GENIX2 琼脂糖凝胶电泳仪北京六一DYY-6C 琼脂糖凝胶成像仪Tanon 3500 四、试验过程 1. 病毒基因组提取 1.1 向 200ul BioTTT001原液中加入 10ul 蛋白酶 K，混匀。 1.2 加入 200ulAL Buffer，震荡 15s混匀；轻微离

44、心后，放入56 度水浴锅内，孵 育 10 分钟。 1.3 加入 200ul 无水乙醇，震荡 15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。 1.4 离心 8000 转 1 分钟，转移吸附柱到新2ml 离心管中。 1.5 加入 500ul Buffer AW1，离心 8000 转 1 分钟。 1.6 弃废液，向吸附柱中加入500ul Buffer AW2，14000 转离心 3 分钟。 1.7 弃废液，空转 1 分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml 离心管中。 1.8 向吸附柱中加入 50ul 超纯水，室温静置1 分钟，14000 转离心 1 分钟 2. 浓度测定 2.1 吸取 2ul 超纯水，滴

45、到样品检测孔处，进行校准。 2.2 抬起测量臂，擦拭残留液体。 2.3 吸取 1ul 待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。 3. 酶切 3.1 配制酶切体系 基因组40ul (约 500ng) EcoR V 1ul Buffer 3.1 5ul 超纯水4ul 总体积50ul 3.2 混匀后，放于 37 度水浴锅中，过夜酶切，约16-18 小时。 4. 电泳 4.1 配制 2%琼脂糖凝胶， 120V电泳，约 25-30分钟， 4.2 成像观察。 试验 3：BioTTT001 基因组 PCR及插入基因 IL-12 PCR 验证 SOP 一、目的 利用 PCR验证 BioTTT001

46、的构建 二、试剂来源、配制及保存条件 试剂来源/品牌货号存储 BioTTT001 深圳S160324A -80 度 QIAmp DNA blood mini kit QIAGEN 51104 室温 蛋白酶 K TIANGEN 04020 4 度 2Mix Vazyme 102151 -20 度 引物（详见附注） DNA Marker TIANGEN 100bp 4 度 三、仪器设备 仪器品牌型号 离心机Thermo IEC MICROMAX 微量分光光度计Thermo NANODROP ONE 恒温数显水浴锅晶 玻HH-S2 振荡器SCIENTIFIC INDUSTRIES VORTEX GE

47、NIX2 PCR仪Life technologies 2720 Thermal cycler 琼脂糖凝胶电泳仪北京六一DYY-6C 琼脂糖凝胶成像仪Tanon 3500 四、试验过程 1. 病毒基因组提取 1.1 向 200ul BioTTT001原液中加入 10ul 蛋白酶 K，混匀。 1.2 加入 200ulAL Buffer，震荡 15s混匀；轻微离心后，放入56 度水浴锅内，孵 育 10 分钟。 1.3 加入 200ul 无水乙醇，震荡 15s混匀；轻微离心后，转移样品到新吸附柱中。 1.4 离心 8000 转 1 分钟，转移吸附柱到新2ml 离心管中。 1.5 加入 500ul Bu

48、ffer AW1，离心 8000 转 1 分钟。 1.6 弃废液，向吸附柱中加入500ul Buffer AW2，14000 转离心 3 分钟。 1.7 弃废液，空转 1 分钟；将吸附柱转移到新的1.5ml 离心管中。 1.8 向吸附柱中加入 50ul 超纯水，室温静置1 分钟，14000 转离心 1 分钟 2. 浓度测定 2.1 吸取 2ul 超纯水，滴到样品检测孔处，进行校准。 2.2 抬起测量臂，擦拭残留液体。 2.3 吸取 1ul 待检测样品，滴加到样品检测处，放下测量臂，记录数据。 3. PCR 3.1 配制 PCR体系： 基因组0.5ul 2Mix 2ul Primer-F 1ul

49、 Primer-R 1ul 超纯水16.5ul 总体积20ul 3.2 混匀后，放于PCR仪进行扩增 ,反应体系如下： 945min 9430s 5530s 7240s 725min 4+ 4. 电泳 4.1 配制 2%琼脂糖凝胶， 120V电泳，约 25-30分钟， 4.2 成像观察。 附注：引物信息 9 5 forward 第 8 对 E3-gp19k 上游 3 reverse 第 11 对 nsIL12 下游 10 5 forward 第 11 对 nsIL12 上游 3 reverse 第 8 对 E3-gp19k 下游 11 5 forward ATGatatgggaactgaagaaag 3 reverse TTAGGAAGCATTCAGATAG 9 28715 30109 E3-gp19k+nsIL12 1394 10 28534 29135 nsIL12+ E3-gp19k 601 11 28534 30109 nsIL1