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1、第 34 讲基因工程 最新考纲 1.基因工程的诞生 ()。2.基因工程的原理及技术 (含 PCR技术 )。3. 基因工程的应用 ()。4.蛋白质工程 ()。5.实验： DNA 的粗提取与鉴定。 考点一基因工程的基本工具及操作过程 1.基因工程的基本工具 (1)限制性核酸内切酶 (限制酶 ) 主要从原核生物中分离纯化而来。 作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 结果：产生黏性末端或平末端。 如下图所示， EcoR限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在 G 和 A 之间； Sma限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在 G 和 C 之间；说明限制酶
2、具有专一性。 (2)DNA 连接酶 作用：将限制酶切割下来的DNA 片段拼接成 DNA 分子。 类型 常用类型E coli DNA 连接酶T4 DNA 连接酶 来源大肠杆菌T4噬菌体 功能只“缝合”黏性末端“缝合”黏性末端和平末端 结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 (3)载体 常用载体 质粒 化学本质：双链环状 DNA 分子 特点 能自我复制 有一个至多个限制酶切割 位点 有特殊的标记基因 其他载体： 噬菌体衍生物、动植物病毒等。 载体的作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。 (1)基因工程 2 种工具酶的化学本质分别是什么？运载体的种类有哪些？ 提示限制酶、 DNA 连接酶
3、其化学本质均为蛋白质。运载体的种类有质粒(常用)、 噬菌体衍生物、动植物病毒等。 (2)限制酶为何不切割自身DNA? 提示限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位 点上进行切割；限制酶不切割自身DNA 的原因是原核生物中不存在该酶的识别序 列或识别序列已经被修饰。 (3)限制性核酸内切酶Mun和限制性核酸内切酶EcoR 的识别序列及切割位点分 别是 CAATTG 和 GAATTC 。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指 部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图 示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。 提示适合的质粒是 。由图可知
4、，质粒 上无标记基因，不适合作为载体；质粒 和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记 基因遭破坏，故均不宜选作载体。 2.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的获取 目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。 获取方法 从基因文库中获取 人工 合成 利用mRNA反转录合成 通过DNA合成仪用化学方法人工合成 利用PCR技术扩增 (2)基因表达载体的构建 基因工程的核心 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的组成 构建过程 (3)将目的基因导入受体细胞 受体细胞种类不同，导入方法不同 生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞 常用方法农杆菌转化法显微注射法转化法 受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti 质 粒的 TDNA 上导入 农杆菌侵染植物细胞 整合到受体细胞的染 色体 DNA 上表达 将含有目的基因的表 达载体提纯取卵 (受 精卵)显微注射受 精卵发育获得具有 新性状的动物 Ca 2处理细胞感 受态细胞重组表 达载体与感受态细 胞混合感受态细 胞吸收 DNA 分子 (4)目的基因的检测与鉴定