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1、实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨 合作者：殷悦涵 实验日期：2016.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节避免它的污染。评价RNA质量的标准是RNA的均一
2、性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在
3、组织细胞中的表达情况。本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和H1299）中的表达水平。二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549（野生型）和H1299（p53缺失型）、p53引物、GAPDH引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、Promega RT-PCR试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop200
4、0超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定（一）RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管加0.2ml氯仿摇匀4，12000rpm离心15min分层取上层水相入新的Ep管中加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min4，12000rpm离心10min，RNA沉淀弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀4，12000rpm离心5min弃上清，晾干，用30l无RNase水溶解沉淀（二）RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和2
5、80nm波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达（一）反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管加入样品RNA2g，以无水RNase水补足体积至9l，70，10min，立即置于冰上。2.设置反转录反应体系，向管内加入MgCl24l10*RT缓冲液2ldNTP2lRNase1lOligo（dT）1lAMV反转录酶1l混匀。42，15min反转录；95，5min终止反应。置于冰上。（二）PCR扩增目的产物每组做两份模板不同的PCR反应1.取两只0.2mlPCR管，分别按下表加入试剂（20l体系，单位：l）：试剂 H129
6、9组A549组2*TaqPCR mix1010p53上游引物11P53下游引物11无菌蒸馏水77H1299细胞cDNA模板1-A549细胞cDNA模板-12.设置PCR反应参数为：94预变性 5min94变性 30s58退火 30s72延伸 30s 共30个循环72延伸 5min（三）RT-PCR产物鉴定：1.配2%琼脂糖凝胶：琼脂糖 2g0.5*TBE 100ml 微波加热融化；冷却至60左右，加入GoldView(DNA染料) 5l 混匀，灌胶2.电泳：向水平电泳槽中加入0.5*TBE至恰好浸没凝胶约1mm左右取15lRT-PCR产物上样，100V电泳2030min结果观察：用凝胶成像仪观
7、察并拍摄电泳结果，以DNA分子量标准（marker）为参照，分析PCR产物大小及p53在两种细胞中的表达情况。理论上，A549是p53野生型的细胞，正常表达p53，该样品的PCR产物经电泳后，应在390bp的位置出现扩增条带；而H1299是p53缺失型的细胞，不表达p53，在相应位置没有扩增条带。管家基因GAPDH作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电泳后在320bp处出现扩增条带。四、实验结果1. 细胞RNA的提取及鉴定提取到细胞RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其Abs260/Abs280为2.03，浓度为4.3989g/l。2. RT-PCR检测p53基因的表达
8、五、实验讨论1. 细胞RNA的提取及鉴定由于在RNA提取实验中，RNA浓度较高，为4.2g/l，导致在取2g的RNA时，只需取0.5l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成误差，因此应将溶液稀释至1g/l左右再取2g的RNA溶液。Abs260/Abs280为2.02，说明我们组提取的RNA较为纯净，提取步骤操作良好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到RT-PCR 的实验中。2. RT-PCR检测p53基因的表达可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带，H1299在390bp处没有出现扩增条带，可说明A549细胞中正常表达p53基因，经过RT-PCR扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带，H1299细胞则不表达p53，不出现扩增条带。由于我组实验结果为阴性，所以不能看出在实验步骤中混入RNase降解RNA，但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套。