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1、9.6 小泡运输的分子机理(molecular mechanism of vesicular traffic)膜结合核糖体合成的蛋白质进入内质网后的运输是通过小泡转运实现的,其机理涉及三个基本问题:小泡是怎样形成的? 不同类型小泡如何准确到达作用部位? 小泡与细胞质膜、小泡与小泡之间是怎样融合的?9.6.1 运输小泡的类型和分选信号在细胞分泌和内吞过程中,从膜上形成的小泡通常由不同的蛋白质包被，因此称为被膜小泡(coated vesicles), 有三种类型的被膜小泡(图9-63)。图9-63 在细胞分泌和内吞途径中三种类型的被膜小泡及运输途径 分泌小泡的类型 披网格蛋白小泡(clathrin
2、-coated vesicle)由网格蛋白形成的被膜小泡, 介导从反面高尔基体网络到细胞质膜、从细胞质膜到反面高尔基网络的运输。从高尔基体反面网络形成的披网格蛋白小泡与从细胞质膜形成的披网格蛋白小泡所用的衔接蛋白(adaptin)是不同的。在披网格蛋白小泡形成过程中, 网格蛋白同膜受体结合, 形成被膜小窝, 并逐渐使被膜小窝下陷, 最后同膜脱离形成一个包有网格蛋白外被的小泡。据估计, 在培养的成纤维细胞中, 每分钟大约有2500个披网格蛋白小泡从质膜上脱离下来。 COP被膜小泡(COP coated vesicle)这种类型的小泡是介导非选择性运输的小泡, 它参与从ER到顺面高尔基体、从顺面高
3、尔基体到高尔基体中间膜囊、从中间膜囊到反面高尔基体的运输。这种小泡的外被是外被蛋白COP(coat protein , COP)，外被蛋白是一个大的复合体，称为外被体(coatomer)， COP被膜小泡(COPcoated vesicle),主要介导蛋白质从高尔基体运回内质网,包括从反面高尔基体运向顺面高尔基体,以及将蛋白质从反面高尔基体运回到内质网。虽然已经发现了三种类型的运输小泡介导不同途径的运输,但还不清楚组成型运输小泡是如何包被的。三种不同小泡虽然有很多差异,但在小泡形成的方式和所需的成份基本一致(图9-64)。图9-64 参与被膜小泡出芽形成的一些组分 出芽形成被膜小泡时需要小GT
4、P结合蛋白、外被体和衔接蛋白、膜受体蛋白等。 三种类型小泡间的差异三种类型小泡不仅外被蛋白不同, 小泡形成时所需的小GTP结合蛋白和衔接蛋白也不相同(表9-10)。表9-10 三种不同类型小泡的外被蛋白、衔接蛋白及运输路线小GTP结小泡类型外被和衔接蛋白合蛋白运输方向网格蛋白网格蛋白重链和轻链,AP2ARF质膜内体(内吞作用) 网格蛋白重链和轻链,AP1ARFGolgi内体网格蛋白重链和轻链,AP3ARFGolgi溶酶体、液泡、黑色体、血小板小泡COPCOP ,ARFGolgiER高尔基体膜囊间的回运 COPSec23/Sec24复合物;Sec13/Sec31复合物;Sec16Sar1ERGo
5、lgi 小泡运输的分选信号三种不同类型运输小泡的形成和定向运输都是由信号指导的。如KDEL信号是内质网蛋白的滞留信号, 因此KDEL是COP型小泡形成的信号。小泡形成不仅需要信号,同时也需要衔接蛋白和信号受体,表9-11综合了三种类型运输小泡的一些信号、受体和衔接分子。表9-11 分泌蛋白与膜蛋白经小泡运输的分选信号蛋白质信号序列*的类型运输方向小泡类型信号受体Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL)分泌蛋白GolgiERCOPI位于高尔基体的 KDEL受体(ERD2蛋白)Lys-Lys-X-X(KKXX)膜蛋白GolgiERCOPICOP和亚基二酸性(如Asp-X-Glu)膜蛋白ERGol
6、giCOP未知M6P分泌蛋白反面高尔基体和质膜向次级内体网格蛋白反面高尔基体和质膜中M6P受体,AP1和 AP2衔接蛋白Tyr-X-X-(YXX)膜蛋白质膜内体网格蛋白AP2衔接蛋白 Leu-Leu(LL)膜蛋白质膜内体网格蛋白 AP2衔接蛋白注:X=任何氨基酸, =各种疏水氨基酸;括号中单字母表示氨基酸的单字母缩写,而非括号中的单字母不仅表示氨基酸缩写,也表示是膜蛋白的细胞质结构域。9.6.2 披网格蛋白小泡形成的机理在大量进行内吞活动的细胞(如肝细胞、成纤维细胞)中,细胞质膜有许多网格蛋白小窝(图9-65)。这些小窝的形成需要很多衔接子(adapter)和网格蛋白,小泡最后与质膜的脱离还需
7、要一种称作发动蛋白(dynamin)的GTP结合蛋白。图9-65 成纤维细胞质面的网格蛋白被膜小窝的电子显微镜照片 网格蛋白(clathrin)及包被亚基(coat subunits)典型的披网格蛋白小泡的直径为50100nm。网格蛋白由相对分子质量为180kDa的重链和相对分子质量为3540kDa的轻链组成二聚体, 三个二聚体形成包被的基本结构单位-三联体骨架(triskelion), 称为三腿蛋白(three-legged protein)。许多三腿复合物再组装成六边形或五边形网格结构,即包被亚基,然后由这些网格蛋白亚基组装成披网格蛋白小泡(图9-66)。图9-66 网格蛋白的结构(a)
8、网格蛋白的三腿复合物;(b)网格蛋白包被亚基;(c)披网格蛋白小泡。 衔接蛋白(adaptin, AP) 和发动蛋白(dynamin) 衔接蛋白在网格蛋白被膜小窝形成时, 网格蛋白和膜之间有一种蛋白质起衔接作用,这就是衔接蛋白。所以衔接蛋白是一种在披网格蛋白小泡形成中起中介作用的蛋白质(图9-67)。图9-67 衔接蛋白与膜受体细胞质结构域中的信号序列相互作用目前已知有三种衔接蛋白:AP1、AP2和AP3。AP1: 衔接蛋白AP1参与反面高尔基体的披网格蛋白小泡的出芽。由于M6P受体蛋白既存在于反面高尔基体又存在于细胞质膜,所以这种受体既能同AP1作用又能与AP2相互作用。AP2: 衔接蛋白A
9、P2是由衔接蛋白(链)和衔接蛋白(链)两种衔接蛋白组成的异二聚体。参与反面高尔基体网络的披网格蛋白小泡的组装。AP3: 最近在酵母和鼠的研究中又鉴定了一种衔接蛋白, AP3，具有AP3突变的酵母,反面高尔基体的某些蛋白就不能被运输到液泡、溶酶体。什么是衔接蛋白? 在小泡装配中起什么作用? 发动蛋白发动蛋白是一种胞质溶胶蛋白,有900个氨基酸, 能够同GTP结合并将GTP水解。发动蛋白的作用是在被膜小窝的颈部聚合,通过水解GTP调节自己收缩, 最后将小泡与质膜割开。 披网格蛋白小泡的形成和运输披网格蛋白小泡的形成分为三个基本过程 被膜小窝(clathrin-coated pit)的形成网格蛋白被
10、膜小窝是披网格蛋白小泡形成过程中的一个中间体。在胞吞过程中, 吞入物(配体)先同膜表面特异受体结合, 然后网格蛋白装配的亚基结合上去, 使膜凹陷成小窝状。由于这种小窝膜外侧结合有许多网格蛋白, 故称为网格蛋白被膜小窝。 披网格蛋白小泡的形成在形成了网格蛋白被膜小窝之后, 很快通过出芽的方式形成小泡，即披网格蛋白小泡, 小泡须在发动蛋白的作用下与质膜割离。由于此时的小泡外面有网格蛋白包被, 故称为被膜小泡。 无被小泡的形成披网格蛋白小泡形成之后, 很快脱去网格蛋白的外被, 成为无被小泡。在真核细胞中有一种分子伴侣Hsc70催化披网格蛋白小泡的外被去聚合形成三腿复合物, 并重新用于披网格蛋白小泡的
11、装配。披网格蛋白小泡形成的过程示于图9-68。图9-68 披网格蛋白小泡的形成过程。 Ca2+ 参与了披网格蛋白小泡包被的形成和去被的过程。在形成包被时, 钙泵将Ca2+ 泵出细胞外, 使胞质中的Ca2+ 保持低浓度, 有利于有被小窝的形成。一旦形成被膜小泡, Ca2+ 同网格蛋白的轻链结合, 使包被不稳定而脱去。简要叙述披网格蛋白小泡形成和运输的基本过程及参与的因子9.6.3 COP-被膜小泡形成的机理COP-被膜小泡介导的是非选择性的小泡运输, 包括从内质网到高尔基体潴泡、从一个潴泡到另一个潴泡、到反面高尔基体网络以及从反面高尔基体向ER的回运。 小GTP结合蛋白(small GTP bi
12、nding protein)小GTP结合蛋白是细胞内的一个大的蛋白家族, 它以两种状态存在: 同GTP结合时, 具活性状态; 同GDP结合, 则是非活性状态。小GTP结合蛋白的活性和非活性状态的转变取决于两种蛋白: 一种是鸟嘌呤核苷释放蛋白(guanine-nucleotide-releasing protein, GNRP), 它催化GDP同GTP的交换。另一种是GTP 酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP), 它触发结合的GTP水解。在COP-被膜小泡的形成中小G蛋白起重要作用。 装配反应因子及COP被膜小泡的形成 装配反应因子(assembly rea
13、ction factor, ARF)装配反应因子被认为是外被体外被的装配和去装配的信号。ARF是一种单体GTPase。当ARF同GDP结合时，游离存在于胞质溶胶中,若同GTP结合，GTP使ARF的构型发生改变，暴露出它的脂肪酸链，并随即插入到供体膜中。同膜结合后的ARFGTP可以同外被体结合，形成被膜小泡。 外被体蛋白质(coatmer protein, COP)COP是一种胞质溶胶蛋白质复合物,由7个亚基组成:、。COP在出芽小泡的胞质溶胶面聚合, 形成COP被膜小泡。由COP作为外被的小泡称为COP 被膜小泡。 COP被膜小泡的形成通过无细胞系统研究了COP运输小泡的出芽过程(图9-69)
14、： 一种胞质溶胶中的小分子GTP结合蛋白,即ARF,释放所结合的GDP,然后同GTP结合,形成ARF-GTP复合物,并整合在高尔基体膜中。GDP与GTP的交换是由高尔基体膜中的一种酶催化的； COP同ARF以及高尔基体膜蛋白的细胞质部分结合；在脂酰CoA(fatty-acyl CoA)的帮助下形成COP被膜小泡,但脂酰CoA的确切作用尚不清楚。一旦COP小泡形成就立即从供体膜释放出来，COP包被去聚合, 并与膜脱离, 这一过程是由与ARF结合的GTP水解所触发。图9-69 COP被膜小泡形成的过程在高尔基体膜中一种酶的催化下,ARF蛋白将所结合的GDP与GTP进行交换,出芽随即开始。ARF-G
15、TP与高尔基体膜中ARF受体结合后,外被体与高尔基体的胞质溶胶面结合并聚合成纤维状外被体,诱导出芽形成小泡。在出芽形成小泡过程中,不仅将被运输的物质包进小泡,也包括其他一些膜蛋白,其中包括V-SNARE,它的作用是导航,指引小泡到达正确的目的地。脂酰CoA帮助小泡与供体膜脱离,随着GTP的水解小泡的外被解聚。 COP被膜小泡介导的运输方向前面讨论过内质网滞留蛋白都有KDEL信号, 如果错误输出到高尔基体,则由位于高尔基体膜囊中的KDEL受体识别并与之结合。这种受体又是如何被COP识别并包装进入COP小泡? 研究发现, KDEL受体的细胞质面有Lys-Lys-X-X序列作为COP的识别信号。同样
16、,其他要回运到ER的蛋白的细胞质面都有这种信号。由此推测, COP被膜小泡介导的运输方向是从高尔基体到内质网的回流。 COP小泡的形成 外被体蛋白(COP)COP小泡介导从ER到高尔基体的运输,所以小泡首先是从ER形成的,其外被蛋白与COP相似但不相同,故称为COP被膜小泡。COP也是多亚基的蛋白复合物, 构成的亚基有Sec23/Sec24、Sec13/Sec31和Sec16等。 COP被膜小泡的装配COP小泡的装配需要一种称为Sar1的G蛋白的参与。当Sar1中GDP与GTP进行了交换, 诱导Sec23和Sec24蛋白的结合,接着是Sec13和Sec31蛋白的结合,最后由一种结合在ER表面的
17、大蛋白质,Sec16与Sec23/Sec24复合物、Sec13/Sec31复合物相互作用,装配成一个完整的小泡。 识别信号在COP的小泡膜上有一个相对分子质量为24kDa的蛋白质帮助选择被运输的可溶性的ER蛋白。COP小泡装配时的识别信号是双酸性分选信号(di-acidic sorting signal), 如Asp-X-Glu。这种信号序列与COP的一个或多个亚基结合。另外,从ER形成的COP小泡常常相互融合成大的运输小泡,这种大的小泡需要以微管作为运输轨道向高尔基体运输。9.6.4 小泡的定向运输、停靠和融合机理无论是选择性还是非选择性的运输小泡, 它们都必须高度选择性地有方向地到达目的地
18、,那么定向运输和停泊的标志是什么呢? 到达目的地后如何停泊?各种小泡都是膜封闭的结构，它们又是怎样突破膜结构的障碍释放出内含物? 运输小泡寻靶: SNARE 假说James Rothman和他的同事根据对动物细胞融合研究的发现, 提出有关小泡寻靶的SNARE假说(SNARE hypothesis)。 NSF和SNAPs他们发现动物细胞融合需要一种可溶性的细胞质蛋白,叫做N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein,NSF)以及其它几种可溶性的NSF附着蛋白(soluble NSF attachment protein,SN
19、APs)。NSF是一种四聚体，四个亚基都相同。SNAPs 有-、-和- SNAPs等。 SNARE 假说由于NSF/ SNAPs能够介导不同类型小泡的融合,说明它没有特异性。据此Rothman提出一种假说:膜融合的特异性是由另外的膜蛋白提供的，把这种蛋白称为SNAP受体蛋白(SNAP receptors)，或称为SNAREs，这种蛋白可以作为膜融合时SNAPs的附着点。 不同的小泡具有不同的SNAREs按照Rothman的SNARE假说，每一种运输小泡都有一个特殊的V-SNARE(vesicle-SNAP receptor)标志，能够同适当的靶膜上的T-SNARE(target-SNAP re
20、ceptor)标志相互作用。一种运输小泡在没有找到合适的靶位点之前有可能同几种不同的膜位点进行过暂时性地接触，这种接触是不稳定的，只有找到真正的靶位点才会形成稳定的结构(图9-70)。图9-70 运输小泡寻靶不同的小泡上具有不同的V-SNARE, 它能识别不同靶膜上的T-SNARE并与之结合,以此保证运输小泡到达正确的目的地。 什么是小泡寻靶的SNARE假说? 提出的依据是什么? Rab蛋白(Rab protein)在小泡运输与融合中的调节作用Rab蛋白家族是真核细胞中控制小泡转运的GTP结合蛋白。 Rab蛋白是一类调节型的单体GTPase, 所有的Rab蛋白都是由大约200个氨基酸组成的,并
21、且有类似于Ras蛋白的重叠结构。它能够结合GTP并将GTP水解,因此认为Rab蛋白通过GTP的循环来调节小泡的融合(图9-71)。图9-71 Rab蛋白的结构 Rab蛋白在小泡的转运和融合中的调节机理可能是：供体膜上的鸟嘌呤核苷释放蛋白(GNRP)识别胞质溶胶中特异的Rab蛋白，诱导GDP的释放并和GTP结合，进而改变Rab蛋白的构型，改变了构型的Rab蛋白暴露出其脂基团，从而将Rab蛋白锚定到膜上。运输小泡形成后，在V-SNARE的引导下，到达受体膜的T-SNARE部位，Rab帮助小泡与受体膜结合。Rab蛋白上的GTP水解后从膜中释放出来，而小泡却锁定在受体膜上，释放出的Rab进入胞质溶胶进
22、行再利用(图9-72)。图9-72 Rab蛋白在小泡运输和融合中的调节作用 Rab蛋白作用的实验证据有一些离体实验支持Rab蛋白在小泡运输和融合中的作用。如Rab5定位于初级内体的膜上, 无细胞系统实验表明, 初级内体间的相互融合需要Rab5的存在, 也不能用其它类Rab蛋白取代。加入Rab和GTP后初级内体间就能发生融合, 说明Rab和GTP是初级内体融合的触发剂。同样发现Rab1蛋白是ER同高尔基体小泡所必需的。什么是Rab蛋白? 在小泡转运中有什么作用?对于Rab的功能有否实验证明? 小泡融合模型根据SNARE假说以及对Rab蛋白等生化和遗传学研究结果表明, 小泡融合时,需要V-SNAR
23、E、T-SNARE和融合蛋白SNAP25的存在。将含有纯化的V-SNARE的人工脂质体与含有T-SNARE/SNAP25复合物的脂质体一起温育,渐渐地两种膜融合到一起, V-SNARE、T-SNARE/SNAP25出现在同一种膜上。在细胞中融合只要几秒钟,但需要几种胞质溶胶蛋白的参与,包括NSF、-、-和-SNAPs,它们的作用可能是使V-SNARE、T-SNARE/SNAP25解离以便于再利用, 同时扩大融合。图9-73是根据体外实验的结果提出的小泡融合模型。图9-73 运输小泡寻靶与融合模型 运输小泡通过小泡膜中的V-SNARE与靶膜T-SNRE/SNAP25复合物的细胞质结构域相互作用,
24、形成螺旋结构,使运输小泡附着到受体膜。小泡膜中的Rab蛋白作为小泡寻靶和融合的定时器； 通过多个V-SNARE与靶膜T-SNRE相互作用以及ATP的水解形成预融合复合物； 预融合开始之后立即进行融合,但详细机理不清； 在融合过程中,相互作用的蛋白进行解离,如T-SNARE/V-SNARE/SNAP25相互分开,促进了进一步的融合； 含有V-SNARE小泡的形成并回到原始膜中。9.6.5 膜的生物发生(membrane biogenesis)细胞质膜以及内膜系统的膜是怎样合成的，曾提出两个模型: 自装配模型(spontaneous self-assembly)。该模型认为膜是自我装配的，为了验证
25、这一模型，用纯化的脂和蛋白在体外装配时总是形成脂质体，这种脂质体与活细胞膜的一个根本区别是:脂质体的结构总是对称的, 而活细胞中膜结构则是不对称的。 更新模型该模型认为膜的合成通过不断地将脂和蛋白插入已有的膜，即由已有膜的生长而来。这一模型比较符合细胞膜结构的动态性质, 由于细胞的胞吞和胞吐作用以及小泡运输,使膜处于动态平衡状态, 这样膜也就不必重新合成,而是在原有的基础上不断更新。 膜脂的来源及不对称性分布 膜脂的两种来源通过磷脂转运蛋白,如线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等细胞器膜中的脂就是靠这种方式运送的。通过出芽和膜融合,如ER通过出芽形成分泌小泡运送蛋白质时,膜脂也随之运送到高尔基体,并
26、通过高尔基体形成分泌小泡将膜脂运送到细胞质膜。 关于膜脂的不对称性分布，有几种可能的方式一种是磷脂交换蛋白对磷脂的运输和插入是选择性的；第二种解释是热动力学驱使磷脂的不对称分布，因为膜两侧的环境不同。另外在ER膜中有翻转酶(flippase),在新的磷脂合成之后,通过翻转酶的作用也会造成磷脂的不对称分布。 膜整合蛋白和外周蛋白的形成用水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)作为模式系统研究了细胞膜整合蛋白和外周蛋白的形成途径。实验结构证明: 外周蛋白: 在游离核糖体上合成后以可溶的形式释放到胞质溶胶中，然后再与细胞质膜的胞质溶胶面结合,成为外周蛋白。 整合
27、蛋白:在ER上合成并插入到ER的膜中,随小泡转运经高尔基体加工,最后转运到质膜。 膜糖膜整合蛋白中的糖蛋白中的糖是在ER腔中添加上的, 所以在整个小泡运输过程中,糖基都位于腔面,但与质膜融合时,通过外翻,糖的部分位于细胞质膜的外侧(图9-74)。这就是为何几乎所有质膜上的糖蛋白的糖都是朝向细胞外的原因。脂锚定蛋白的形成脂锚定蛋白与膜的结合有几种不同的机制: 糖脂锚定的膜蛋白细胞质膜外的一些蛋白是与糖基磷脂酰肌醇(GPI)共价结合的, 属于这种类型的脂锚定蛋白是在粗面内质网上合成,然后在ER腔中被连接到ER膜的GPI上，随后通过小泡运输,经高尔基体出芽形成小泡,最后与质膜融合,含糖的一面外翻朝向
28、细胞外侧(图9-74)。 脂肪酸锚定膜蛋白的形成此类膜蛋白通过与脂肪酸链的共价结合被锚定在质膜的细胞质面。连接的脂肪酸包括豆蔻酸(myristic acid, 一种14碳的饱和脂肪酸)和棕榈酸(palmitic acid,一种16碳的饱和脂肪酸)。此类蛋白是水溶性的,在游离核糖体合成后释放到胞质溶胶中,然后才与包埋在质膜中的脂肪酸共价结合。生物膜是怎样合成的?可能的机理是什么?图9-74 膜整合糖蛋白和膜糖脂锚定蛋白在质膜中定向机制新合成的膜整合糖蛋白插入质膜的过程分三个阶段:通过出芽从ER上形成含有新合成的跨膜糖蛋白的膜运输小泡,并同高尔基体融合;从高尔基体复合物形成含有膜糖蛋白的小泡融入并运到细胞表面; 小泡与质膜融合,糖蛋白暴露于细胞外。糖脂锚定蛋白插入到细胞质膜的过程与膜整合糖蛋白的过程相似,也要经过三个阶段。