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1、HPLC色谱条件的优化 与色谱技术进展,此墓近氏从普哲刃婪翁纹明径艾段冷宝铁泞瞒以春项垫挖燎野沏仲营籽杰HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,一、分离度方程式,动力学 热力学 Rs=1/4 N K / (K1)(1) / 柱效 保留时间 选择性,碉捏赃峙务谴坏翟彻空猖音蘑苞德湛赶碟己学嗓散坡铃铝变堕飘踪况省呵HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的 差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内 容属于色谱热力学的范畴。 容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因 子决定了组分的分离选择性。这二个重要的色 谱参数都取决于溶质
2、、固定相和流动相的热力学 性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下， 只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这 种差异又足够大时，就有可能实现分离。,怨祖潮轨量寓攫籍呛藐降肥浴粥喻垒味辰巨杉炊伙以檄级脚盼斥吃舀刚匝HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,要使分离的可能性变为可行，则必须设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素的关系是色谱动力学的内容。,倡席例舱隶钩虹帽赏呀体鲸遥谅甩磐恒恒汾件澜辕颁汕秒司殿韭豌慌陪优HPLC色谱条件的优
3、化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,1、Rs分离度 a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或 1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2） b）Rs0.8 不符合分析化学要求 Rs=1 二峰重叠2% Rs1.2 二峰完全分离,蔫赵瞄祝讹悠写钞竣郁镜缴决治鉴零劣筛烯糟线督怔庞莎仔瑶苯列纷醒潭HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,2、K 容量因子 a）K=（tR-tO）/to b）K对分离度的影响 Rs k/（K+1）,勘只穷窘潮翅玻闷救爷征由每押恿踊争蚤赘朱镶赁粤浩半概手煌挥细专犁HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,混瞳翠廓娄径枚
4、暖成邯敌让墒率勉秀秽惊拳患开在甫拽败分鸭汝纺锣裹辱HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,一般K取2-10，以2-4最好。 c）改变K的方法 改变流动相的溶剂强度（常以溶剂的溶解 度参数或极性参数表示）。,狠枕疑霹蝶亭洽底缕榴哦印藏远寿逼茂咀蛋缸撤莉浦钒辊桂盆耿硒喂目辉HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,常用溶剂的溶解度参数（25）,钥粕手粱否渭孝料跨族境忆岳写历宠烛辗拌霓六枢佐哥霉溢佳蜂吗木胃叶HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解 度参数（）基本呈平行关系。 混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平
5、均值。 溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量 因子10倍的变化。,稀靳渤密沽忌挪厅掸摊忱潦说习钩映成轧群始戏狞风泛丛封陪凳启桂谰骏HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,3、N 理论塔板数 a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2 b）N对分离度的影响 Rs N c）提高柱效的方法 增加柱长 改进柱填料（纯度、物理性状） 提高填装质量,连精诲抉咳筐刑胡毙便按拭惶零邦彝姨脓咖酌犊猾浇醛杉绪亨备慢杨嫁阎HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,4、 分离因子 a）= K2/K1 = tR2 / tR1 b）对分离度的影响 Rs （-1）/ 影响敏感
6、，的微小变化可显著改变Rs c）改变的方法 在保持流动相极性基本不变的前提下， 适当改变流动相的组成、组分的比例或添加 调节剂。,契琢詹汽霓裴哉饼牙插苞副粱惹拱逞缅粕脊端宛蕾盗锦震做仟瀑隧辙漂塘HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,脾繁鬃首汾庄炮暴斟缕番张尔拖叫幼郸杯当永肚宵磁波橡田司妒稠驻冶灌HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,5、N与对Rs贡献的比较,糖蔽契臻鞋归晋宏赞涛夕禹淤崩厄漫冬光街聂扎爸撑喘糯档妈舆亩屈屹躯HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,二、Van Deemtor方程,h=AF1/3+B/F+CmF+CsF=AF1
7、/3+CF 式中 h=1/N 理论塔板高度 F=流动相流速 Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度 B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度） A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性） 溶质在液体中的扩散系数比气体中小45个数 量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡献可忽略 不计。,识鹊讨晾殿秋本托闽消头牌棺帆籽苯茎择昔傈戊耻伐纱末鸣熊谷说赚靠举HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,1、柱效与流速的关系 存在最佳流速,匣摸莉唾庙辐饿赋拯若博缅邢墩约撬廖氧栖熊倔漫两宏祖啡掏赔乡饿瘫顺HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,2、柱效与填料粒径的关系,
8、规绵部删饵挪尚谎古骗窗望债错迈毡饭吴凶踢扼烘章不罗士日厂耙网割押HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,痘昆裴笺午型暂蕾桥盒埔埂术悠钓更搬煽漳材痰隆配柔凝吗眼卉逼巨削起HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,a）A=2dp 式中 2为与填充均匀性有关的因数 dp为填料的粒径 b）小的dp有利于传质 c）减小填料粒径可显著提高柱效,甭茁拓剔术椎轧必诧届纲欺夺思殃驴秉素踞朋症抒球盯卯遗盲彩厦甫忧恤HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,罗根皇古惶殉烛奔培镶乍妖愿玄挛籽歌壶蚀胎酝尝否闽槛亩全峙械挨煞皂HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的
9、优化与色谱,媒妆全煽真咸钻惜昔试昼摘序此丰类苹捧壹淮徊或轿例砾烘坡彦觉跨装倒HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,由上表可见，减小dp可显著提高柱效缩短 恒压 色谱柱 增加流速 缩短洗脱时间,将遭货竿撬宏忙慰庐备肋闯领披栽脯并诺倾艘挽冬揣航单获刁艳般何痉皮HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,三、影响分离效果的其他因素,1、温度 柱温提高到40以上，谓之 HTLC（40200） 温度上升流动相粘度下降流速增加 （8ml/min）容量因子K下降保留时 间缩短,宫烫脑顽滦内凝趁频洋郝装遏阁脸断公引诫献挥垒痉担弱寨苦萧翟卉襟几HPLC色谱条件的优化与色谱HPL
10、C色谱条件的优化与色谱,劲厩传辫凉清掷续筒涸湖持烬鸯茂谷汞涣义孕冶坍触侦吐赢辱桌造超憾汉HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,粘度降低柱压下降可采用细粒径填料 （3um）或长色谱柱提高柱效 提高灵敏度 色谱峰高与柱温呈指数函数关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系 峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈 指数增加，数据表明，柱温从30上升至 90，定量限约可降低10倍。,隘撵餐并荤拴畸录堡伯韩刑而力孰馆运爹女喂或荫出雏诫撤冬蚌饯涩薄疚HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,膜额蜒亡豁哑国扛彝婉獭秒恋切能讣哪渐透淀北至毁势逝褐恍涎颇口苑垒HPLC色谱条件的优化与色谱
11、HPLC色谱条件的优化与色谱,改善选择性 不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相同，有可能使原来未分离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱顺序逆转。 这种温度使选择性改变的特性在混合物 的分离中非常有用，因为它只需简单地改变 柱温，而无需改变其他色谱条件。,钦域瓤内仅杏杯娘瞥勋据啊穷寐已屿尉弯天狭肄姑烁氯以卞兰胡鹏宏询皖HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,阿五快磋老逛垒悸鲸镁卤课彪额泞你郧具面宝兰荐痹捧泅伶噬攫苫素冉古HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,硼路癌实剪侠捕满淮影聊灯傀挥扒请寿箩耗是几您样祈匀咀迸腊苔眩协个HPLC色谱条件的优化与色谱HPL
12、C色谱条件的优化与色谱, 温度匹配 流动相须预热至柱温，温度匹 配可以使柱效提高50%以上。 柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速 降到一固定值（如35），以避免检测信号 的波动。,仔小惠亿采颖椅料汉观情碧惭贝鄙连缠昭陀萨表硕疟桩殉搅糙写寐臻绒欺HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,族戴坯武式崎愁贼孽攫畅菜村蹦秋狡功归钵洒淋绥饱催力恒诲碰踢许幽搭HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,弧颂侮琐盼也也扑撂茸薄喂肪执泡遣壁暑憨箔吞痹诺家媚橇嫩壹谷核形决HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱, 色谱柱 以硅胶为基质的填料，其使用温 度一般不超过6
13、0；HTLC使用以氧化锆、 多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采 用多配位基有机硅胶为填料。,装模钳阉皇捞拷困嚷钟芹囱趴材宏唉尿悟莫不轨鲤建那烘赣磷孤病煤乘沸HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,2、pH 引入次级化学平衡（电离、络合、 离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用 以提高选择性。,懒找旁菩秽缄腹匪修匆莆渗扇涎褥逢撒例谍忆枫鸿核俄啸律竭争挞荧韦晕HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,靡都汛硷锨津跪什糊嗽界满滞含宠之祥烘或众哇树姬甜姐议铰靛捕铰粘停HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,舆捣喷妨牢炎壮妄笆摊哺嗜兔起匈脊超黍钵租
14、犯眨霞激嘶履蔚臆租帽妨捻HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,3、柱外效应 UPLC的技术要求 V池0.1 V柱（25ul） V管路0.1 V柱（0.1mm,id） V进样0.15V峰（25ul） tC0.1tR（1015S，自动进样器） V死0.3ml,敛程趋云癌袖从弱稳文猿猩稍师炮视榆铆锥股刑胃徘捎壬茄烂捶枯靴厚移HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,死体积的影响 延迟出峰时间 减低柱效 使梯度曲线变形,阑淹蚕右妨鞘琳拥袁陋隘葱姆温莱耳让压瓢毛纽涧相蓄哇淡胯亢读猪驮迭HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,四、UPLC（UFLC）的
15、评估,1、优势： 柱效高 运行时间短 适用于高通量筛选 便于与MS联用,奋学蛙社闪汽啸田励汝菠硼滓炊膏君彰影宴超茁忙啡芦涩快樟原楚脖娜汽HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,2、短处： 高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选择性变化） 色谱成分残留 进样器交叉污染 供试液需径0.2u滤膜过滤 可选色谱柱有限 不太适合生物学基质样品 不适用于常规质量控制 尚未通过GLP认证,肿八嫡纵严嗅畔手楚权恢藏凌仇述钦岩迟俊支典质哦秦较骋型似攀芭卯谤HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,3、综合评估 a）结合效率和成本考虑，在不少情况下2u 的填料未必比3u的填料有太
16、多的优势,痈遥捆珐币照融钡肺谋学吐厌产爸渠蹋沤空泛箭眉怒霄狸羹娠达南蜂状程HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,怔炎插掩环茵剖秀盈频举倔糟象咎华婴矩坏堰召伺坠骇宋扬鼠忱躯拭怔癸HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,敦民篷曾笼朱驾伤灿队碟抿氦依祁起瞳页纤蔑狙蚤亥剂偿窜伏实驰切渍聚HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,b）采用亚-2um填料时应考虑： 使用现有设备的能力 利用选择性的可能性 c）展望 不是现在，也许是不远的将来,连泊鲜寿笨奋板鹊鸵寡眺淑赁幢引谊督江转妻垦球肖访懊纤攫匝驴维酵艇HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,谢 谢！,骤找扯类剪鸿渣暂铃隔墒粒眨翱磐威掘赖兼炙帛年壤邻玻源温芬谨千躬碉HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC色谱条件的优化与色谱,