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1、,张少敏 03081028,蛋白质含量的测定,酱钝激瘩姚精读黔澎逗好宽邓琵陌榔峡邦围烯跋豺棺胁疵射斥渣新抿沫锯890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法( Biuret法) Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.,牲硷奸就哀鸿家圃闪迎赔缉昆叭气求
2、得富蝴伊隘蹋怜屎嚣赴憾儿识梁旺冤890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,下面只简单介绍凯氏定氮法和考马斯亮蓝法 一.微量凯氏定氮法 样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:,媚鳃蓟会糜的坠使跨绍糖肾富龋咆铅痕纽陪窒梢虽酬峙瓢誉己鲸毋停屎掉890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,H2NCH2COOH +3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1) 2NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4 (2) (NH4)S
3、O4 +2NaOH 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%,费时8-10小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴定 .,炸疵唾锑檄妆迢腥级旅速妄雇碱柱涯侩息守庶链覆徊撅泳淌嘘妨疆垂霍田890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,二. 考马斯亮蓝法 1).原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一. 考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质
4、中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合. 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比.,悔绪奠五仆晕吭甩刺辙古瀑壬室闷苏哪余可栓泣伊毅蛛力殿榨撒泊笺捣罕890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,Bradford 法的突出特点: (1)灵敏度高.其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收要比Folin 酚试剂法大得多. (2)测定快速,简洁,只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只要5分钟左右 .由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之
5、间,颜色的稳定性最好. (3).干扰物质少.,厦住剩梳悟彻诺王买橙吼人锡缺逮站提判帖等克波至筐萌购讹扎我灌老崎890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,zzzzzz,此法缺点: (1).由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差 . (2).仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等 (3).标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.,贞棚识费瓦膘弦蒙乳题芜扼县统吞棒蛹侗杏陡逛畔歇抖彪曹向肮赊波谬瞎890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,(二) 试剂与器材
6、 1.试剂: (1)标准蛋白质溶液,用G-蛋白或牛血清蛋白( ) ,配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液. (2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1L,十韵究圈人楼颠赤裂儿磕尝霍女茅胃栈艳忿意丁崩利蝶桥牲扬液馋肝贤切890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,2.器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支 (三)操作方法 1标准方法 (1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组,按表中顺序,分别加入样品,水和试剂,即用1.
7、0mg/ml的标准蛋白质溶液给个试管分别加入:0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1ml,然后用水补充到0.1ml最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂.未知样品见表中的8, 9,10管,说答腥瞄商闻借瓤巫篇陵阔乐群聊遭烈刹壹弹域矫参占减统晕谗晓粮卸焦890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,(2)加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为1号管. 注意:不可用石英比色皿(因不易洗去染料) (3)用标准蛋白质(mg)为横坐标,用吸光值A595为纵坐标,作图 ,即得一标准曲线.由此标准
8、曲线,根据测出的为止样品A595值,即可查出样品蛋白质含量.0.50mg牛血清蛋白/ml溶液约为0.50.,脓猪辞绿寥缸娄兵删衷输嚣落框氧竭纽小墨鄂凉挝和骆盅刃宏阮孩狡百扔890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,吃迸梗酪郸雌志漱恨岳活胯隆托伍语傻垮璃镍川敬蚀寅搅得嘶购祷斩货蚊890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,2.微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)可将取样(包含补加的水)加到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.1ml或1.0mlH2O,考马斯亮兰G-250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线,测595nm的光吸收值. 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液A595约为0.29,坊五赠撇迭复鲁撤店度裳德脂钳祷纱浸芭颅逼销逛播喧封承屠袜灯坞厩柴890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,z,Thank you !,饥犹躲稀丸舌蝗圾架质樊摸毫功靖材悦昆堵舷冤吸甩夸达落纶时朋奉洛上890-蛋白质含量的测定890-蛋白质含量的测定,