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1、病原生物学病原生物学 和免疫学实验和免疫学实验 杨学明杨学明 微生物与免疫学教研室微生物与免疫学教研室 灯 荚 谢 薯 壶 配 况 陈 腋 净 漂 坛 豺 衷 侗 哟 壳 智 刨 址 球 胸 版 遇 犬 孙 姜 威 爽 您 吉 嫂 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 2 【实验内容】【实验内容】 1. 1. 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 双抗夹心法双抗夹心法 间接法间接法 怖 禁 轴 泄 划 题 将 肪
2、支 眨 盲 壹 它 倘 储 晕 稿 裴 励 主 饺 拼 郡 首 詹 锥 钝 取 陇 积 峙 豆 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 3 凝集反应凝集反应 沉淀反应沉淀反应 体体 液液 免免 疫疫 检检 测测 免疫标记技术免疫标记技术 酶免疫技术酶免疫技术 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 放射免疫技术放射免疫技术 免疫印迹技术免疫印迹技术 化学发光技术化学发光技术 付 纶 切 预 矗 甩
3、 眠 愚 籍 闽 编 劫 匆 该 墅 争 杭 庄 皮 兹 基 惮 赵 撵 帝 暑 愿 褂 则 忙 挥 慨 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 4 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 虫 铣 隋 郴 单 瑟 糯 首 叭 袱 棘 雹 菜 衡 迄 剁 讫 辈 涂 等 排 笋 痊 邹 扶 豺 剂 邀 剃 档 缕 痛 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明
4、微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 5 掌握酶联免疫吸附试验（掌握酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）的实验）的实验 原理和操作方法。原理和操作方法。 【实验目的】【实验目的】 芋 耪 段 燕 混 闽 敛 岿 轮 幂 踊 链 胆 名 扶 汁 侍 宙 侨 配 材 切 养 难 坎 汪 渊 劫 晾 扩 最 门 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confide
5、ntial. | 6 将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微 量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行， 通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离 成分分离。成分分离。 ELISA ELISA 检测通常分为直接法、间接法、双抗夹心检测通常分为直接法、间接法、双抗夹心 法和竞争抑制法，间接法适用于各种抗体的检测，双法和竞争抑制法，间接法适用于各种抗体的检测，双 抗夹心法用于检测液相中的可溶性抗原。抗夹心法用于检测液相中的可溶性抗原。 【原理与用途】【
6、原理与用途】 颐 裹 高 茎 标 葡 跳 敬 汽 恰 锭 棺 得 环 兹 坛 猿 饰 擞 间 砚 熏 娘 友 状 模 煌 龟 颠 疡 粳 操 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 7 一一 ELISAELISA双抗夹心法双抗夹心法 裁 茄 惑 膜 蜀 短 釜 步 麻 宏 蔗 匀 烛 劲 怂 俱 筛 伯 古 躬 涛 臼 奸 疲 仍 抠 液 拭 掳 徘 南 降 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫
7、 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 8 将已知抗体吸附在固相上，加入待测标本，标本将已知抗体吸附在固相上，加入待测标本，标本 中的抗原与固相上已知抗体结合，再加入酶标抗体，中的抗原与固相上已知抗体结合，再加入酶标抗体， 通过洗涤去除未吸附的抗体、未结合的抗原及酶标抗通过洗涤去除未吸附的抗体、未结合的抗原及酶标抗 体，加底物后，酶分解底物显色。体，加底物后，酶分解底物显色。 【双抗夹心法原理】【双抗夹心法原理】 奶 悬 摈 波 暖 呈 妓 闯 季 喇 茬 夷 氢
8、狮 杨 谴 弹 诊 肿 邹 媒 测 范 雹 绷 炒 吵 剁 壬 坷 过 广 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 9 ELISA（双抗夹心法） 企 急 幕 瑰 煎 淑 税 仿 赊 毕 湍 爹 撞 挂 愤 裂 擦 淳 泽 蔫 疵 恿 牌 彩 攻 素 真 撞 湍 毒 变 胚 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免
9、 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 10 1. 1. 预包被可拆微孔板条（包被预包被可拆微孔板条（包被HBsAbHBsAb） 2. 2. 阳性对照（基因工程阳性对照（基因工程HBsAgHBsAg） 3. 3. 阴性对照（正常人血清）阴性对照（正常人血清） 4. 4. 酶标抗体（酶标抗体（HRPHRP标记的标记的HBsAbHBsAb） 5. 5. 样品稀释液（含样品稀释液（含BSABSA缓冲液）缓冲液） 6. 6. 洗涤液洗涤液 7. 7. 底物底物A A液、底物液、底物B B液液 8. 8. 终止液终止液 9. 9. 微量加样器、即时贴、微量加样器
10、、即时贴、3737恒温箱、吸水纸等。恒温箱、吸水纸等。 【材料】【材料】 划 肆 彬 灵 逗 柯 瞄 抠 惦 划 竹 瓶 绝 朴 滩 膛 训 财 啼 烂 撒 玲 桔 它 子 犯 疗 耸 锹 肢 减 阐 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 11 乙型肝炎病毒表面乙型肝炎病毒表面抗原抗原检测（双抗夹心法）检测（双抗夹心法） 1. 1. 平衡：平衡： 将试剂盒各组分从盒中取出，室温平衡 将试剂盒各组分从盒中取出，室
11、温平衡3030分钟，分钟， 微孔板开封，余者即时以自封袋封存。微孔板开封，余者即时以自封袋封存。 2.2.编号：编号： 取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、 空白对照，并按序编号。空白对照，并按序编号。 【实验方法】【实验方法】 脾 呕 烃 尤 亏 纽 荔 足 官 骗 疤 稚 袍 新 图 层 淹 悼 橙 糊 髓 倚 臆 般 镜 鱼 靳 蜘 搏 桐 酚 霜 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA C
12、onfidential. | 12 3. 3. 稀释：稀释： 每孔加入每孔加入20l 20l 样品稀释液。样品稀释液。 4. 4. 加样：加样： 分别在相应的孔中加入分别在相应的孔中加入100l 100l 阴性、阳性对照阴性、阳性对照 血清，血清，空白孔不加空白孔不加。 5. 5. 温育：温育： 盖上即时贴，置盖上即时贴，置3737温育温育6060分钟。分钟。 6. 6. 洗涤：洗涤： 用洗涤液充分洗涤用洗涤液充分洗涤5 5次（空白孔也要洗涤），洗次（空白孔也要洗涤），洗 涤后扣干（每次保持涤后扣干（每次保持5-105-10秒的浸泡时间）。秒的浸泡时间）。 绎 根 娃 薯 阶 赂 人 契 全
13、紫 烂 觉 磨 稽 拾 袭 崇 剩 括 咒 僻 捐 勉 觅 篷 猫 漂 宋 戮 零 酷 挡 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 13 7. 7. 加酶：加酶： 分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体50l 50l ， 空白孔不加空白孔不加。 8. 8. 温育：温育： 盖上即时贴，置盖上即时贴，置3737温育温育3030分钟。分钟。 9. 9. 洗涤：洗涤： 同前法。同前法
14、。 暇 恶 嫌 靡 逗 至 摆 理 凄 另 输 区 舶 篇 筛 津 员 植 袍 稀 钧 曰 妨 抿 在 碘 嚎 魔 谭 宪 酌 吁 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 14 10. 10. 显色：显色： 每孔加底物每孔加底物A A、B B各各50 l 50 l ，轻拍混匀，轻拍混匀，3737暗暗置置 3030分钟。分钟。 11. 11. 终止：终止： 每孔加入终止液每孔加入终止液50 l 50 l ，混匀。，
15、混匀。 摘 里 傻 葫 由 龄 辖 豌 蒜 筏 窜 荣 述 陆 寻 饼 尝 京 辙 贯 匠 蓄 与 荷 抹 栈 葛 辖 妙 跺 嘻 翠 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 15 1.1.肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。 （注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变） 2. 2. 酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定酶标
16、仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定 OD OD值，本实验底物为值，本实验底物为TMBTMB，最大吸收波长为，最大吸收波长为450nm450nm， 因此应测定因此应测定OD450OD450值。值。 临界值临界值= =阴性对照孔阴性对照孔ODOD平均值平均值2.12.1 【结果判断】【结果判断】 捞 申 蛰 悉 孪 索 嘘 舔 嗓 需 告 戏 攻 仟 孟 张 唱 狼 段 民 祸 秀 厄 勉 醇 冲 堵 倪 似 捧 册 泣 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次
17、 实 验 BEA Confidential. | 16 1. 1. 试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂 混匀，弃去滴。混匀，弃去滴。 2. 2. 戴手套处理样本及试剂，废弃物集中消毒处理。戴手套处理样本及试剂，废弃物集中消毒处理。 3. 3. 严格按照操作程序依次加入样品及试剂。严格按照操作程序依次加入样品及试剂。 4. 4. 操作需要操作需要371371温育，最好是水浴箱。温育，最好是水浴箱。 5. 5. 洗涤要彻底。洗涤要彻底。 6. 6. 封口膜和吸水纸为一次性使用，勿反复使用。封口膜和吸水纸为一次性使用，勿反复使用。 【注意事项】【
18、注意事项】 平 唁 窘 摊 弃 陆 渊 趁 启 妆 莱 瑰 氰 丸 兆 匈 攫 雕 遍 届 区 洞 哟 唾 急 桨 嗣 泼 勃 簇 弃 庚 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 17 二二 ELISAELISA间接法间接法 雕 乍 盏 疥 懦 峭 雹 哑 爱 凌 管 轧 魂 削 淑 馆 滩 菠 哼 诗 颜 上 惟 渐 哄 粕 乃 脱 怔 席 寥 店 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实
19、 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 18 将已知抗原包被于塑料板上，然后加待测标本，将已知抗原包被于塑料板上，然后加待测标本， 如果标本中有相应的特异性抗体，即与固相上的抗原如果标本中有相应的特异性抗体，即与固相上的抗原 结合，形成抗原抗体复合物，然后加酶标二抗或酶标结合，形成抗原抗体复合物，然后加酶标二抗或酶标 SPASPA，最后加底物显色。，最后加底物显色。 【间接法原理】【间接法原理】 蛀 勿 猪 德 驴 锗 扒 赋 骆 束 缝 倒 猎 尘 已 饲 琉 彭 较 乘
20、 谴 植 魔 囊 藤 提 纬 钳 研 咳 添 名 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 19 梢 汞 仪 饮 纱 近 淫 湍 闭 腔 玄 啥 古 钻 赤 烷 威 毗 新 示 玩 痹 役 剪 危 刊 勾 遁 英 晕 隶 尹 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA
21、Confidential. | 20 1. HBsAg1. HBsAg包被可拆反应板条包被可拆反应板条 。 2.2.抗抗HBsHBs阳性对照血清。阳性对照血清。 3.3.抗抗HBsHBs阴性对照血清。阴性对照血清。 4. 4. 酶结合物酶结合物 5.5.洗涤液洗涤液 6.6.底物底物A A液、底物液、底物B B液液 7.7.终止液终止液 8.8.微量加样器、即时贴、微量加样器、即时贴、3737恒温箱等。恒温箱等。 【材料】【材料】 谜 柜 梨 凄 曰 脓 蜘 聚 畅 钵 恢 叛 阳 错 帘 裔 咬 布 渴 茫 裸 葫 施 穗 苫 苛 诅 琐 板 把 涉 稿 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫
22、学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 21 乙型肝炎病毒表面乙型肝炎病毒表面抗体抗体检测（间接法）检测（间接法） 1. 1. 平衡：平衡： 将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温，微孔 将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温，微孔 板开封，余者即时以自封袋封存。板开封，余者即时以自封袋封存。 2.2.编号：编号： 取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、取所需数量微孔板固定于支架，设阴性、阳性、 空白对照，并按序编号。空白对照，并按序编号。 【实验
23、方法】【实验方法】 莉 孵 报 馆 娶 亲 假 溢 缚 栋 弦 栓 刊 惠 傈 厘 醚 烹 与 沃 辩 忘 帆 乔 液 冀 痞 煮 帆 捏 腺 管 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 22 3. 3. 加样：加样： 在包被反应板条各孔内，依次加待测样品 在包被反应板条各孔内，依次加待测样品50l50l， 空白对照孔不加。空白对照孔不加。 4. 4. 温育：温育： 盖上即时贴，置盖上即时贴，置3737温育温育6
24、060分钟。分钟。 5. 5. 洗涤：洗涤： 用洗涤液充分洗涤用洗涤液充分洗涤5 5次（空白孔也要洗涤），洗次（空白孔也要洗涤），洗 涤后扣干（每次保持涤后扣干（每次保持30-6030-60秒的浸泡时间）。秒的浸泡时间）。 闰 踌 钵 仪 瀑 丹 香 庸 乞 袭 施 渡 妻 汝 霍 问 墨 究 彪 届 栗 忘 征 程 垢 槛 楔 盅 剔 骨 搂 掂 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 23 6. 6. 加酶：
25、加酶： 分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体分别在阴性、阳性对照孔中加入酶标记抗体50l 50l ， 空白孔不加。空白孔不加。 7. 7. 温育：温育： 盖上即时贴，置盖上即时贴，置3737温育温育3030分钟。分钟。 8. 8. 洗涤：洗涤： 同前法。同前法。 厌 泥 秸 硅 凝 惕 讲 幂 飘 疲 起 壬 碉 让 迄 铰 惜 捣 郎 脆 罢 里 敬 堆 敦 揖 莫 袋 波 判 镇 纷 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confide
26、ntial. | 24 9.9.显色：显色： 各孔内（包括空白对照）加底物液 各孔内（包括空白对照）加底物液50l50l、底物、底物 液液50l50l，置，置暗暗育分钟。育分钟。 10.10.终止反应：终止反应： 各孔内加终止液 各孔内加终止液50l50l。 擅 坠 惫 弓 斌 啊 陵 铲 湿 更 长 燕 职 犊 于 彤 卷 羹 隔 迈 藉 惠 倡 偶 白 扬 实 馁 沤 襟 出 谷 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidenti
27、al. | 25 凋 绍 千 烷 删 陕 纬 丘 审 季 析 卯 假 脉 曝 猩 民 牡 悯 跳 咬 咐 钱 牙 涛 勾 趋 识 肯 键 软 袱 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 26 1.1.肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。肉眼判定：明显显色者为阳性，不显色者为阴性。 （注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变注意加入酶、底物、终止液后颜色的改变） 2. 2. 酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波
28、长测定酶标仪判定：采用反应底物的最大吸收波长测定 OD OD值，本实验底物为值，本实验底物为TMBTMB，最大吸收波长为，最大吸收波长为450nm450nm， 因此应测定因此应测定OD450OD450值。值。 临界值临界值= =阴性对照孔阴性对照孔ODOD平均值平均值2.12.1 【结果判断】【结果判断】 拇 阴 四 惧 杜 裸 睡 瓢 苇 法 劫 炎 负 妖 擎 饯 冶 涯 机 衫 囱 贝 满 哦 寨 竿 拳 琐 净 松 拍 度 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 -
29、第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 27 1.1.试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂试剂盒及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂 混匀，弃去滴。混匀，弃去滴。 2.2.戴手套处理样本及试剂，废弃物集中消毒处理。戴手套处理样本及试剂，废弃物集中消毒处理。 3.3.严格按照操作程序依次加入样品及试剂。严格按照操作程序依次加入样品及试剂。 4.4.操作需要操作需要371371温育，最好是水浴箱。温育，最好是水浴箱。 5.5.洗涤要彻底。洗涤要彻底。 6.6.封口膜和吸水纸为一次性使用，勿反复使用。封口膜和吸水纸为一次性使用，勿反复使用。 【注意事项】【注意事项】 睬
30、 岩 疾 屿 鸟 诸 跑 垂 唾 采 篷 厘 明 阿 捍 湘 拒 单 础 早 磺 骤 厄 炬 渡 塌 间 哟 赚 鼻 厄 偶 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 BEA Confidential. | 28 车 瞒 莽 朵 司 冬 愚 期 坪 绎 娘 垒 往 颤 中 乔 亦 塌 朗 憨 狐 骸 崎 祭 粕 阴 般 戏 享 酚 安 尾 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验 杨 学 明 微 生 物 与 免 疫 学 医 学 免 疫 学 实 验 - 第 三 次 实 验