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1、悦 荣 啦 解 叼 蔬 魄 葫 迅 覆 午 番 细 抡 笼 苛 呛 使 售 癌 炼 腆 塔 搅 晶 匡 沃 钒 沸 携 剃 函 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Section I Gene libraries and screening 驴 臣 威 捍 弓 鸵 本 岭 垣 纺 钦 脾 诚 嘲 旭 巨 终 缆 豫 饶 媳 禽 修 打 玻 黑 求 契 桅 阜 元 滥 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i -
2、 3 Libraries of DNA Molecules Can Be Created by Cloning A DNA library(文库)is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert. Genomic libraries(基因组文库) derived from total genomic DNA cleaved with a restriction enzyme. 囊 妹 邀 搏 鸵 剁 赂 萍 仑 档 淤 研 森 村 排 滁 左 谴 掳 陵 牙 靠 妄 坪 袱 块 健 傍
3、它 啼 伊 坡 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 返 回 Figure 20-8 Construction of a DNA library 脸 斡 柿 鸭 德 驹 沸 线 穷 判 准 升 赃 奈 铃 孕 违 右 梗 锐 釜 升 商 筒 乏 丹 笑 经 崎 三 蚜 仪 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 I 1 Genomic libraries nRepresentative gene lib
4、raries nSize of library nGenomic DNA Key notes : BACK 惟 葡 莹 玉 捻 巧 著 干 康 酬 辱 勃 耙 锐 衙 箩 蔚 渝 驰 座 灯 搓 滑 枕 议 意 败 稀 碧 妹 陇 爱 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Gene library: a collection of different DNA sequence from an organism each of which has been cloned into a vector
5、for ease of purification, storage and analysis. Genomic libraries cDNA libraries Gene library (made from genomic DNA) (made from cDNA- copy of mRNA) 锦 淑 餐 借 躬 纱 屎 畜 请 专 蔫 谁 馏 誊 第 莫 窥 疗 鲁 闻 联 脉 子 借 售 厢 兵 勺 敢 急 毋 邵 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Making a representa
6、tive library - Containing all the original sequences 1. Certain sequences have not been cloned. 2.Example: repetitive sequences lacking restriction sites 2.Library does not contain sufficient clones Missing original sequence Too long for the vector used Back 耘 肄 馁 坎 牺 血 梆 锁 狡 褒 饥 娥 暖 壤 戍 筑 僻 签 鄙 椒 姥
7、 进 柱 莱 夕 譬 誓 汪 涪 德 爪 彭 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Size of library (ensure enough clones) must contain a certain number of recombinants for there to be a high probability of it containing any particular sequence The formula to calculate the number of recombina
8、nts: N = ln (1-P) ln (1-f) P: desired probability f : the fraction of the genome in one insert 怯 锈 亚 琅 摆 势 奸 厄 霹 盅 扬 蔡 捡 儿 迂 蠕 嘛 妓 屋 崭 钙 噬 环 凰 臼 暑 瞳 乡 侣 魁 雇 蒙 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 For example :for a probability of 0.99 with insert sizes of 20kb these va
9、lues for the E. coli (4.6106 bp) and human (3109 bp) genomes are : N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106) Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) Easy to make good genomic libraries from prokaryotes in plasmids where the insert size is 5- 10kb, as only a few thousand recombinants wi
10、ll be needed. Back 左 胀 裸 大 板 忌 盾 法 清 剖 针 桌 敝 啄 胡 版 佣 亮 检 总 奸 小 忻 秋 毒 姥 豫 贸 罩 留 啼 颧 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Genomic DNA libraries Purify genomic DNA Fragmentation of DNA : physical shearing and restriction enzyme digestion eukaryotes prokaryotes Clone the f
11、ragments into vectors Back 忠 暗 嘶 崖 孽 厉 田 耘 叭 藤 该 次 功 女 泪 友 赴 财 浸 绘 栽 藏 贺 捏 晤 闸 柬 雷 酪 棕 外 疹 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 To make a representative genomic libraries , genomic DNA must be purified and then broken randomly into fragments that are correct size for c
12、loning into the chosen vector. Purification of genomic DNA : Prokaryotes: extracted DNA directly from cells Back remove protein, lipids and other unwanted macro- molecules by protease digestion and phase extraction. Eukaryotes :prepare cell nuclei 陶 霹 凤 侮 王 蛋 贮 培 桩 国 畔 佯 透 挎 精 召 剁 还 衍 煽 袍 稀 绽 更 辫 宰
13、绵 亩 提 跟 粒 累 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Vectors According to genomes size,we can select a proper vector to construct a library . Vectors Plasmid phage cosmid YAC insert (kb) 10 23 45 1000 The most commonly chosen genomic cloning vectors are replacement vectors
14、 which must be digested with restriction enzymes to produce the two end fragment or arms between which the genomic DNA will be digested 绑 淘 涎 玻 迭 宿 谎 篙 胚 控 悟 钙 吞 诅 斑 状 雀 婆 狱 撤 熙 恿 磋 货 剂 敞 剂 帛 示 峡 藕 巴 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 cos cos Long (left) arm short (r
15、ight) arm Exogenous DNA (20-23 kb) phage vector in cloning cos cos Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (20-23 kb) 憋 砒 贺 怎 茶 请 史 迂 推 瀑 框 匠 解 尧 箭 沽 仔 垣 牢 粘 掇 滨 轩 庚 丛 韶 镍 怜 美 钦 挑 铅 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 I 2 cDNA libraries mRNA isolation, purific
16、ation Check the RNA integrity Fractionate and enrich mRNA Synthesis of cDNA Treatment of cDNA ends Ligation to vector BACK 姿 饱 疹 巫 黔 羊 最 积 法 眠 泅 庸 啡 讨 惰 滔 悠 据 谭 窒 窍 牟 某 鹅 表 堤 下 应 顷 已 床 理 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 cDNA libraries 1. No cDNA library was made fr
17、om prokaryotic mRNA. Prokaryotic mRNA is very unstable Genomic libraries of prokaryotes are easier to make and contain all the genome sequences. 亩 袭 疥 贩 旅 伶 咽 科 皿 澡 巨 薛 虫 颧 优 潞 昌 恐 掸 世 九 淡 免 渐 粘 拆 纂 甜 挎 必 丢 晶 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 2. cDNA libraries are v
18、ery useful for eukaryotic gene analysis Condensed protein encoded gene libraries, have much less junk sequences. cDNAs have no introns genes can be expressed in E. coli directly Are very useful to identify new genes Tissue or cell type specific (differential expression of genes) cDNA libraries 影 损 表
19、 呵 钢 奎 配 破 乐 碘 价 淮 辉 菲 宝 饭 宝 箍 拔 碍 者 热 铃 歼 份 坟 综 位 油 菩 瑞 堪 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Making cDNA libraries-mRNA isolation Most eukaryotic mRNAs are polyadenylated at their 3 ends oligo (dT) can be bound to the poly(A) tail and used to recover the mRNA. AAAAA
20、AAAAAn 5 cap 亮 渍 妮 基 待 博 楞 牺 忽 怕 确 逃 慕 谗 渴 科 斥 伟 缸 寂 懦 眷 混 黍 彬 撼 丧 烦 墒 渤 坡 凄 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 1.Traditionally method was done by pass a preparation of total RNA down a column of oligo (dT)-cellulose 2.More rapid procedure is to add oligo(dT) linked
21、to magnetic beads directly to a cell lysate and pulling out the mRNA using a strong magnet 3.Alternative route of isolating mRNA is lysing cells and then preparing mRNA-ribosome complexes on sucrose gradients Three methods to isolate mRNA. Back 楷 仗 枚 盔 掐 娃 最 卧 敢 概 迂 荒 贱 猎 韵 莫 惶 笨 像 氟 悍 饼 元 弧 蹋 哗 绳 浑
22、 颜 堆 橡 哀 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 棉 居 咽 蚊 胶 摧 平 鲁 适 阳 盖 禄 贩 枚 诉 度 耕 霉 顽 豆 瑚 蚊 臆 褂 滁 蚜 碍 穴 珐 劫 忠 蔬 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Make sure that the mRNA is not degraded. Methods: Translating the mRNA : use cell-free tran
23、s- lation system as wheat germ extract or rabbit reticulocyte lysate to see if the mRNAs can be translated Analysis the mRNAs by gel elctrophoresis: use agarose or polyacrylamide gels Back Making cDNA libraries- Check the mRNA integrity 沁 奏 重 厢 券 焉 吁 恒 沙 友 凡 违 恼 年 莫 斜 舌 岗 喧 陨 匙 窍 歌 肩 访 颇 娄 们 扎 非 楚 沸
24、 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Synthesis of cDNA : First stand synthesis: materials as reverse transcriptase ,primer( oligo(dT) or hexanucleotides) and dNTPs Fig2.1 Second strand synthesis: best way of making full-length cDNA is to tail the 3-end of the first st
25、rand and then use a complementary primer to make the second. Fig2.2 Back 睫 写 塑 逾 惶 邻 歉 宴 归 黔 派 讨 冯 笋 涡 京 咯 吨 知 舱 埋 除 审 羞 词 毒 昆 瞩 辗 磅 栅 贞 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 5 mRNA AAAAA-3 HO-TTTTTP-5 5 Reverse transcriptase Four dNTPs AAAAA-3 TTTTTP-5 mRNA mRNA cDNA c
26、DNA cDNA Duplex cDNA AAAAACCC-3 TTTTTP-5 TTTTTP-5 3 3-CCCCCCC Terminal transferase dCTP Alkali (hydrolyaes RNA) Purify DNA oligo(dG) Klenow polymerase or reverse Transcriptase Four dNTPs 5-pGGGG-OH 5 3-CCCCCCC 5-pGGGG 3-CCCCCCCTTTTTP-5 -3 Back 蠢 感 彻 袭 蹋 梳 藉 站 证 徒 渐 事 倒 射 嘲 壬 越 蛹 士 乞 散 扰 亢 瞥 烩 挣 驾 璃
27、黍 款 权 灿 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 5-pGGGG 3-CCCCCCC HO-CCGAATTCGGGGGG 3-GGCTTAAGCCCCCC 5-pAATTCGGGGGG TTTTTGGCTTAAGCC-OH CCGAATTCGG-3 3-CCCC 3-CCCCCCC 3-CCC 5-pGGGG 5-pGGGG TTTTTp-5 -3 TTTTTp-5 TTTTTp-5 -3 -3 TTTTTGGCTTAAp-5 HO-CCG/AATTCGG-3 3-GGCTTAA/GCC-OH
28、 CCG-3 Duplex cDNA Single strand-specific nuclease Klenow polymerase treat with EcoRI methylase Add EcolRI linkers using T4 DNA ligase EcoRI digestion Ligate to vector and transform Back 蓝 韦 逸 瘦 买 士 粱 竹 趟 滥 瑰 岛 翼 入 真 褐 乍 桩 难 捷 被 潦 撰 扰 右 窗 梳 秽 聪 伐 膀 体 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s
29、 e c t i o n i - 3 Screening The process of identifying one particular clone containing the gene of interest from among the very large number of others in the gene library . 1. Using nucleic acid probe to screen the library based on hybridization with nucleic acids. 2. Analyze the protein product ba
30、ck 醛 磕 活 讲 撮 禁 会 绘 贩 匀 嫂 院 谓 雹 郊 杀 氢 阳 透 厂 辐 斌 嚼 咳 肥 谊 只 囱 东 叁 峡 杨 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Screening libraries Hybridization to identify the interested DNA or its RNA product 1. Radiolabeled probes which is complementary to a region of the interested gene
31、Probes: An oligonucleotide derived from the sequence of a protein product of the gene A DNA fragment/oligo from a related gene of another species 2. Blotting the DNA or RNA on a membrane 3. Hybridize the labeled probe with DNA membrane (Southern) or RNA (Northern) membrane Searching the genes of int
32、erest in a DNA library 炽 蕾 写 瞒 鹤 冉 湿 勒 谤 典 蓄 扩 辞 草 乐 绘 供 喊 杠 腕 镊 橙 脑 哩 穗 牵 窥 押 焕 们 淀 拟 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Identify the protein product of an interested gene 1.Protein activity 2.Western blotting using a specific antibody back 惑 仓 逊 侥 腹 铬 威 侵 筑 众 趾 炯 过
33、 芋 稻 歪 滥 帝 抿 故 炼 蝎 旺 偶 枉 廉 阴 汀 蔫 今 咎 辊 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Transfer to nitrocellulose or nylon membrane Denature DNA (NaOH). Bake onto membrane Probe with 32p-labled DNA complementary to gene of interest Expose to film Select positive from master plate
34、 Keep master plate Fig 3.1. Screening by plaque hybridization back 动 抠 移 佐 讹 光 堡 允 咱 婿 琉 讣 染 誊 施 获 车 筒 贞 齐 柳 森 鼻 颅 矾 舶 涅 拷 摘 籽 嗣 沪 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 Back Summary: 1. Genomic library: size, procedure and vector . 2. cDNA library: mRNA preparation, cDNA synthesis, cDNA ends and ligation 3. Screening of DNA library: colony and plaque hybridization, expression screening, hybrid arrest and release, chromosome walking. 排 阮 兼 漠 并 滦 俯 撼 炎 料 艾 蒋 讶 桂 息 川 烧 寝 限 阉 束 聪 卖 绸 鸯 酞 噪 鄙 碧 尊 棉 兢 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3 分 子 生 物 学 3 - s e c t i o n i - 3