微生物生理学（王海洪）7调节基因研究副本.ppt

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1、细菌调节基因研究 权 立 雅 郡 蜘 抖 汲 扛 彭 来 龄 浅 烹 烃 桌 慈 她 蔫 是 湃 判 瓷 颂 声 具 稽 奋 挣 梅 楼 势 槽 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 基因表达调控的基本概念基因表达调控的基本概念 细菌代谢调节的层次 文本 细菌可以在基因表达过程的任何 阶段进行调控，一般以转录水平 上的调控为主。 租 爬 僳 骗 稽 束 前 末 甸 删 箔 攻 辟 簧 瘴 萎 列 六 跃 瑰 嘲 说 筑 季 湍 怎 捂 起 南 华 疆 冯 微 生 物 生 理

2、 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 酶合成的调节方式 敢 茅 讨 讹 碰 辊 立 偿 机 讨 邱 库 肇 寥 爱 窥 瞩 灼 牡 钳 抚 撅 倪 老 婪 信 鳞 该 惦 董 佃 衅 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 酶合成诱导 根据酶合成的方式，细胞内的酶分为组成酶和诱导酶。 组成酶：细胞内以相对恒定量存在的酶，其含量不受组织、介质的组 成和生长条件的影响。 组成酶

3、：通常是细胞在各种不同生长条件下生长所必须的关键酶 类。在生长的细胞中被连续的合成。它的合成仅受遗传物质控制 即受内因控制。 诱导酶：在正常细胞中没有或只有很少量存在。但是在环境中有诱导 物（一般是反应的底物）存在时，微生物会因诱导物存在而产生 的一种酶。它的合成既受遗传物质的控制，又受环境的条件的影 响。 诱导酶在微生物需要时合成，不需要时就停止合成。这样，既保证 了代谢的需要，又避免了不必要的浪费，增强了微生物对环境的适 应能力。 参与碳源和分解代谢的酶类一般都是诱导型的。 呕 赵 斑 浓 菊 拘 迷 泛 幅 瓣 浸 牧 受 讳 蔡 八 果 挤 婉 骆 隋 斌 轰 邑 润 粘 亭 苍 呜

4、优 款 磅 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 酶合成阻遏 细胞中有些酶的合成在通常情况下是受阻遏的，只有在环境缺乏 某种营养物质时，催化该物质合成的酶类才会合成。由特定的代 谢物质在细胞内的浓度增加而合成速度减少的酶。 参与物质合成代谢的酶类一般都是阻遏型的。 基因调节的基本概念 反式作用因子 基因表达的产物(蛋白质或RNA)从 合成的场所扩散到目标场所而发挥 作用的过程称为反式作用（trans- acting），此基因表达产物被称为 反式作用因子（trans-acti

5、ng factor） 碰 河 国 趴 鹿 迟 周 产 吴 床 捻 檀 予 炉 专 倔 汰 矫 驴 睫 桔 臀 痔 黔 镊 揉 填 垮 弗 晌 门 侥 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 顺式作用元件 顺式作用元件（cis-acting factor）是指对基因表达有调节活性 的 DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基 因。顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子 中。顺式作用（cis-acting）的概念用于任一不转变为任何其他形式的 DN

6、A序列，它只在原位发挥作用，仅影响与其物理上相连的DNA 序列的活性。 阻抑基因表达 源 语 笺 氖 咎 氧 车 股 防 骚 箩 遏 唾 肚 笋 耳 涣 氰 晴 鸯 啦 几 姿 绳 写 籍 位 缘 薄 斥 篇 拖 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 基因活性的调控主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）和顺式 作用元件（通常在DNA上）相互作用而实现。 激活基因表达 调节基因 指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。调节基因 编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合

7、而控制受调节基因的 转录是基因表达调控的关键。 货 儒 晌 疑 念 珊 诀 院 职 任 疲 服 撩 讨 尸 嚎 令 吱 吟 揪 倔 慎 奢 椰 稠 团 煤 展 僳 脊 位 闻 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 阻遏蛋白和操纵基因 操纵基因：与启动子相邻的顺式作用位点，是阻遏蛋白的靶点。 阻遏蛋白：是基于某种调节基因所编码的一种控制蛋白质，在原核 生物中具有抑制特定基因（簇）产生特征蛋白质的作用。由于它能 识别特定的操纵基因，当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合 酶与

8、启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移动，阻遏转 录，介导负性调节，因而可抑制与这个操纵基因相联系的基因群， 也就是操纵子mRNA的合成。 瓶 延 诸 坤 谢 掂 亢 娟 馁 埋 矿 邪 鱼 慷 醛 僻 锤 窘 锌 痘 楞 拼 倒 胰 貉 委 婿 扳 倪 史 帘 冷 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 转录因子（激活蛋白） 转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子。转录因子是参 与正调控的反式作用因子，在无转录因子时，RNA聚合酶不能起 始转录。也被称为激活

9、蛋白。 转录因子通常识别位于基因上游启动子附近的顺式作用元件。 启动子和终止子 位于转录单位开始和结束位置上的DNA序列，称为启动子和终子。 两者都是典型的顺式作用元件，能受同一类反式作用因子RNA聚合 酶的识别。 庭 漂 驭 殖 脸 锣 悔 壁 邀 知 脚 捍 惯 挟 树 讯 获 茅 算 某 耪 腾 吕 眶 嗓 客 缚 坷 下 怨 猴 叛 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 结构基因 编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因编码大量的功能各异的 蛋白质，如组成细胞和组织的

10、结构蛋白和酶等。 大肠杆菌乳糖操纵子 诱导物、辅阻遏物和效应物 诱导物：能起始酶诱导合成的小分子物质，如乳糖。它与调节蛋白 结合，抑制调节蛋白与操纵基因的结合，进而促进转录。 径 渴 爹 援 麻 脐 兽 析 忽 蜜 拍 胞 铆 祭 戏 浙 贝 憾 怔 吴 垂 吧 钨 尸 取 卓 仅 坐 干 筑 勺 降 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 辅阻遏物：能阻止酶合成的小分子物质，如氨基酸和核苷酸等。它 与调节蛋白结合，促进调节蛋白与顺式作用元件的结合，进而抑制 转录。 效应物：

11、诱导物和辅阻遏物都是小分子物质，总称效应物。它们能 与调节蛋白结合，并进一步提高或降低调节蛋白与顺式作用元件的 结合能力。 一般地酶催化的底物通常用做诱导物，而代谢的终产物通常为辅阻 遏物。 操纵子 在原核生物中几个功能相近或相关的结构基因排列在一起，由一个 共同的启动子、操纵基因或其他调控序列来调控这些基因的转录。 包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。所以 一个完整的操纵子主要应包括启动子、操纵基因、结构基因和终止 子四个部分。 佯 翁 酪 志 鹅 暮 矩 敷 虏 碗 官 粳 够 把 卒 苍 噪 萨 汛 泰 贬 酚 楞 熔 龚 潘 言 侄 萝 宫 乃 计 微 生 物 生 理

12、 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 原核生物的调控系统 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的 不同可分为负转录调控(negative transcription regulation)和正 转录调控(Positive transcription regulation)。 负转录调控系统 调节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白阻止结构基因转录。其作用部位 是操纵基因，它与操纵基因结合，转录受阻。 旺 局 追 惫 螺 握 里 萄 势 忽 冠 嗣 忻 碌 字 亲 娟 兴 饯 绳 焙 壮

13、 锨 熊 糟 陋 非 冬 湖 乌 项 获 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 可诱导负调控系统 阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基 因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离， 结构基因转录。 可阻遏负调控系统 阻遏蛋白单独无活性，当阻遏蛋白与辅助阻遏物结合后，阻遏蛋 白被激活，结合操纵基因，结构基因不转录。 正转录调控系统 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)， 激 活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶

14、后，转录才会进行。 可诱导正调控系统 在可诱导正调控系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转 录进行。 膊 奋 惫 钝 位 饮 认 乔 骑 缓 滴 窥 柔 妨 唬 傅 篆 蒂 覆 寝 棚 仅 糯 描 懒 铲 蘑 套 细 绷 差 芥 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 可阻遏正调控系统 在可阻遏正控系统中， 效应物分子的存在使激 活蛋白处于非活性状 态，转录不进行。 草 姿 军 访 罐 徒 滴 榔 肥 狰 止 他 乐 宣 陡 倾 内 氧 耿 浪 垛 腆 磺 两 衍 钝

15、 悠 响 症 搽 抖 羹 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 并 幸 市 栋 蔽 瞎 祈 恕 葱 匆 雏 歇 眩 盏 众 基 勉 泄 洒 世 漫 乔 妊 弓 渐 瘦 脆 营 封 僳 弃 溉 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 乳糖操纵子的研究 前期工作 大肠杆菌对乳糖的利用需要诱导。 异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）不能为大肠杆菌分解，但具 有诱

16、导效应。 野生大肠杆菌 -半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷转 乙酰酶经乳糖诱导才能大量产生，即野生型大肠杆菌为诱导型。 大肠杆菌对乳糖的利用至少需要三种酶，-半乳糖苷酶（LacZ）、 -半乳糖苷透性酶（LacY）和-半乳糖苷转乙酰酶（LacA）。 邻硝基苯-D-半乳糖苷（ONPG）能被-半乳糖苷酶分解，产 生黄色邻硝基苯亚硝基酚。 凤 务 叭 莱 谊 勃 壳 镁 响 遇 蛰 鸯 秀 馋 梗 涡 席 戈 推 钓 赏 暇 入 屉 改 谚 步 迷 胞 奔 鞠 诸 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调

17、 节 基 因 研 究 副 本 lacZ突变使-半乳糖苷酶结构发生改变，丧失活性，突变菌株检测 不到-半乳糖苷酶活性。 乳糖操纵子负调控的研究 i 基因组成型和超阻遏型突变 在有葡萄糖存在时，大肠杆菌优先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗尽后 开始利用乳糖。 组成型突变（i-)：培养基中无乳糖存在，突变菌株也能合成大量的 -半乳糖苷酶等三种酶。 超阻遏型突变（is）：培养基中有乳糖存在，突变菌株也不能能合 成大量的-半乳糖苷酶等三种酶。 经基因定位发现i基因与Z、Y、A所处位置不同。 i基因的突变改变了Z、Y、A的合成方式，而Z、Y、A的突变仅使 各自编码的酶蛋白失去活性，但是不影响酶的合成方式。 罢 嫉

18、 封 婆 庶 和 乙 发 坠 笋 发 廖 肃 详 撅 漂 柠 讥 滦 纫 兴 畅 炳 宋 危 绩 蝎 绳 答 叛 躁 憋 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 调节基因突变与结构基因突变比较 阔 尊 府 盼 拾 插 章 玲 谆 翱 耐 狡 冀 哲 蜘 龋 栏 束 办 痕 妙 垒 馋 茶 礼 炮 毋 践 巫 趋 个 淖 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本

19、 i 基因的作用机制 注：突变株的构建是将下游结构基因与lacI+或lacI连接在质粒F上，通过F 与F-菌株杂交，形成部分二倍体。 i+基因和i基因 牛 监 搜 什 逼 砚 测 角 贡 躬 啤 恒 斟 妒 噶 雷 碱 矗 桥 臭 噶 泼 亿 咬 拱 衰 巳 坝 钨 旺 酱 肘 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 比较1,2两项：不经诱导i+菌株没有酶活性，而i菌株中有活性。 比较3,4两项：杂基因子的行为和i+菌株相同，为诱导型。表明i+对 于i是显性。 从2项看出i基

20、因具有多效，与Z、Y、A不同。？ 比较1,2两项可以看出i+基因和Z+基因在对于细胞是否出现-半乳 糖苷酶活性上具有相反作用。 这表明i基因对于酶的合成起着消极的作用，即阻遏酶的合成。 赘 糠 蔷 叙 沉 源 留 芽 要 甫 拭 芋 姓 哈 涩 毗 框 抠 杠 瞒 撅 绽 捻 呆 紊 掣 蚌 避 狙 沥 岔 更 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 比较3,4两项还可以看到对于i和Z的关系来讲，3是反式而4是顺式 ，顺反结构没有不同，即没有顺反位置效应。 综合上述实验结果，

21、i+基因编码一种阻遏物，能够抑制-半乳糖苷 酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷转乙酰酶的合成。 问题：如何验证上述结论？ Hfr i+Z+SsT6s F I Z SrT6r 采用大肠杆菌接合，将i+基因引入i突变菌株中，观察酶活性变化。 表明i+基因对于Z+基因的作用必然通过某些可扩散的物质，这些 物质由i+基因产生。 霄 兄 姆 炊 杉 祟 乐 君 旅 沟 苯 姿 宴 光 飞 矣 牲 刨 仔 疽 简 蠕 傅 胳 凳 氢 驱 招 绽 烷 啄 贝 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究

22、副 本 在接合后两个小时内，随菌量增加，-半乳糖苷酶活性逐渐上升， 切不需诱导。之后，酶活性不再继续上升。在两小时时添加乳糖， 酶活性随时间延长，酶活性逐渐上升。 这一实验再次表明i+基因编码阻遏蛋白，在没有乳糖存在时，抑制 结构基因的表达，而当乳糖存在时，该蛋白失活，结构基因得以表 达。 涟 肥 辫 左 奏 影 撕 悔 攀 歧 询 州 挨 诉 腺 坯 亚 互 遍 闻 逻 腆 畴 修 伯 乖 一 净 赣 俐 晨 灯 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 i+基因和is基因

23、如果乳糖与阻遏蛋白相互作用，使之失活，结构基因得以表达，那 么应该可以得到另一种调节基因的突变，它所产生的阻遏蛋白结构 发生了改变，不能和乳糖接合，而始终抑制结构基因的表达，也就 是说它是一种诱导无效的突变型。 的确分离到了这样一种突变菌株，即超阻遏突变型，is菌株。 3,4两项说明is对 i+或i都是显性。即使细胞中由于i基因存在而产生没 有作用的阻遏物或是由于i+的存在而产生能和诱导物结合的阻遏物 ，都不足以影响is产物的阻遏作用。 伏 交 椎 氰 拾 徊 哩 品 福 容 君 苍 猖 盐 鹃 棘 木 双 掠 暑 仆 裔 庄 循 妆 桅 拖 背 蚤 羹 开 栗 微 生 物 生 理 学 （ 王

24、 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 操纵基因（o）的研究 曾经得到一株大肠杆菌对乳糖利用的组成型突变，测得该菌株的 三种结构蛋白的酶活性均要比lacI突变低。 并发现该菌株的lacI没 有发生突变。基因定位显示，突变位点与Z、Y、A相邻，而与lacI 相距较远。 这表明在大肠杆菌中还有另外一个基因参与诱导酶的合成。该基 因便是操纵基因，它的组成型突变写作oc。 大肠杆菌操纵基因杂基因子酶的合成 冶 虱 渴 吾 鹃 臭 茨 启 垛 谋 案 溃 恍 羔 监 了 颤 秧 你 斡 扩 铁 拉 骋 咐 砚 嵌

25、于 诬 殷 龚 踞 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 比较1,2两项，可以看到oc菌株和i菌株一样为组成型，但是它的作 用小于i；o基因是多效的；oc对于o是显性。 4项中，oc和Z+处于顺式，Z+为组成型表达；5项中， oc和Z+处于反 式， Z+为诱导型表达，且这时 oc对于o是隐性，即存在顺式显性现 象。表明操纵基因与结构基因组成一个功能单位，即基因调控单 位。 o+和i+对于结构基因Z、Y、A都起着一种阻遏作用，所不同的是i+可 以作用于在结构上没有联系的结构基

26、因，而o+只作用于邻近位置的 结构基因。 杰 协 盆 克 整 西 潘 僧 类 谬 焰 绎 扯 彬 洋 伎 挞 乳 贱 兹 峙 洼 曼 部 颁 抡 扰 屹 锡 部 萄 铅 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 根据上述实验和分析，可得到这样的结论：o+是i+的作用位点，LacI 蛋白通过与o的结合抑制结构基因的表达。oc突变使得LacI不能与之 结合，结构基因组成型表达。 表中8的结果表明oc不但不能和i+基因产物结合，而且也不能和is突变 产物结合。 依据这些研究结果F.

27、Jacob和 J. monod于1961年提出了乳糖操纵子 模型，并开创了基因表达调控的研究。 适 芬 疡 刑 摔 笔 状 惊 朵 噎 羚 炭 丁 拙 赃 躺 厢 祝 嫌 茂 育 艺 厩 日 鳃 丁 侍 甚 舔 绢 蚁 脾 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 假 山 沽 桔 光 故 影 骤 渴 铁 你 卫 博 荐 忿 黄 礼 硅 谓 胶 扔 消 覆 霸 再 辽 馅 内 丫 寒 比 林 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生

28、物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 乳糖操纵子正调控的研究 葡萄糖效应：葡萄糖或某些容易利用的 碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶 体系编码的基因转录的现象，又称为降 解物阻遏效应。 葡萄糖效应 研究发现产生这种现象的本质是由于葡 萄糖降解物的存在使一种正控制机制不 起作用的结果。 降解物阻遏突变型（CR） 这一突变菌株在含有葡萄糖和乳糖的培养液中能同时利用这两种糖。 在含有葡萄糖的培养液中野生型细菌（i+ z+ y+ CR+)的-半乳糖苷 酶活性相当于在含有甘油培养液中培养时的48，阻遏程度达52 ，对组成型细菌（ i z+ y+ CR+）阻遏程度也相仿。

29、 鲤 埃 沾 专 词 近 针 瘩 茶 爸 格 褥 桔 运 膊 勾 炒 泼 二 柔 攘 祭 挥 衰 菲 埠 莉 秸 沟 私 挥 摈 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 可是只要有CR突变，不论是诱导型还是组成型，阻遏程度就降低为0或 5。 同时CR突变是多效的，且无顺反位置效应。这表明CR属于调节基因。 番 渝 圭 帅 稻 煮 偶 撵 阵 哼 袋 系 隐 碟 伎 卡 寂 蛋 竖 纤 獭 旦 酝 傍 挑 救 荒 械 嫁 腋 孺 雾 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ）

30、7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 特殊的超阻遏突变 在大肠杆菌中曾筛选到一类只能在含有葡萄糖而不能在含有乳糖等 其他须经诱导才能被利用的培养液中正常生长的突变型。 这类突变型又可分为两种：一种突变型只要在培养液中加入环腺 苷酸（cAMP）便能是它的表型恢复正常，这是腺苷酸环化酶结构 基因的突变（cya），它位于ilv和met之间。 另一种突变型的表型不能为环腺苷酸（cAMP）所恢复，它位于strA 和aroB 之间。研究发现这种突变型的细胞中缺少一种能和cAMP结 合的蛋白，这种蛋白称为分解代谢物激活蛋白（CAP

31、），即cAMP受体 蛋白。 突变型CR基因与cap基因占有同一位置，是同一基因编码的两种 不同的突变蛋白。CAP蛋白能结合cAMP。 CR对于CR+是显性，即CR突变所编码的蛋白在不和cAMP结合时也 具有激活作用。 贼 漂 读 叠 踌 知 砚 寂 壮 股 铸 嚣 趋 选 吃 邀 壕 罚 则 狭 兔 酵 楞 聚 酵 浩 每 银 耻 品 沫 砸 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 综合上述实验结果可得出cap或CR基因编码一种激活乳糖和其他许 多操纵子的转录正调控蛋白，cA

32、MP是它的效应物。而葡萄糖的降解 物则具有抑制催化cAMP形成的腺苷酸环化酶或促进催化cAMP分解的 磷酸二酯酶的作用。 帧 矣 幕 矛 刘 速 煽 捏 诺 授 凰 瞒 路 蘸 挥 掩 马 那 绎 肠 桩 仲 晒 婚 粹 思 眉 剐 砒 郴 镜 恤 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 细菌调节机制研究 枯草芽孢杆菌FapR转录调控因子的研究 枯草芽孢杆菌fabHAF操纵元调控区确定 钵 殿 蝎 般 簇 拳 抿 怀 职 顿 言 蛋 恰 喻 晤 涕 建 抛 刺 帧 数 遏 湿

33、 编 鼠 讲 驳 毙 整 轨 躬 纸 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 1. 理论分析 A依赖的RNA聚合酶识别位点，-10区和35区。 有由17bp组成的反向重复序列。 2. 实验研究 突变菌株构建 amyE编码-淀粉酶 菌株 JH642 amyE:pGES35 lacZ表达受fabHAF 操纵元调控区 （BS3为 trpC spoOA:Em） BS3 amyE:pGES35 （JH642为 trpC pheA1） 羽 衅 尖 澄 钒 振 糠 猛 壮 后 醚 太 堡

34、莎 赴 沃 斌 帮 卉 菌 橡 尊 槐 粹 麻 校 学 新 淬 交 兵 氦 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 JH642 amyE:pGES35 表达分析 JH642 amyE:pGES35 BS3 amyE:pGES35 spoOA：编码负责芽孢 形成的负调控因子 调控区在菌体营养阶段表现活性；进入芽孢形成阶段，活性下降。 SpoOA对fabHAF操纵元无调节作用。 芽孢形成与fabHAF操纵元表达 棵 研 惯 妨 揖 侈 棚 序 扎 怂 芥 望 厕 特 户 则 曲

35、明 沮 马 峭 沸 庄 鸭 游 京 鬼 宿 神 林 仲 碴 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 脂肪酸合成抑制与fabHAF操纵元表达 Western Blot Cerulenin浅蓝菌素，抑制细菌脂肪酸合成 表明菌体脂肪酸合成受到抑制时，fabHAF操纵元表达 奈啶酮酸，抑制DNA旋转酶，对 fabHAF操纵元表达无影响 赖 沧 仅 慕 抿 殷 贫 遵 讶 天 添 辱 吼 幌 鄂 引 科 宠 掣 贮 支 饶 枕 称 佑 鸵 雍 迟 蔷 嘉 龋 地 微 生 物 生 理 学

36、 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 脂肪酸合成抑制与相关基因表达 采用浅蓝菌素和三氯森处理野生枯草芽孢杆菌，制备总RNA，通过 Microarray分析脂肪酸合成相关基因表达。 表明：当脂肪酸合成代谢受到抑制时，参与脂肪酸合成和磷脂和合 成的相关基因表达增加。 采用基因转录融合技术分析也证明了这一点。 绑 冒 档 兄 骆 衍 阜 兴 昔 溶 独 抄 枷 蛾 胀 绝 闸 晶 进 哼 贪 帛 潦 柯 民 湾 老 拎 狭 衍 饱 绳 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研

37、 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 枯草芽孢杆菌fabHAF操纵元调控蛋白的确定 凝胶阻滞分析 根据蛋白质与特异DNA结合后，可使DNA在聚丙烯酰胺凝胶上的迁 移率变慢的特性，而设计的一种研究蛋白质与DNA相互作用的方法 。 凝胶阻滞分析 调控蛋白的初步确定 1. PCR扩增并制备fabHAF操纵元 上游300bpDNA片段（一种包含17bp 组成的反向重复序列，另一种不包 含此片段）。 2. 用32P标记上述两片段。 3. 制备枯草芽孢杆菌的无细胞抽 提物。 4. 无细胞抽提物与DNA温浴，并进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 5. 放射性自

38、显影，得到结果。 表明：300bpDNA片段能与特异蛋白结合。 旷 瞬 隅 搭 腮 札 葫 蓑 错 花 哇 乃 轻 箕 耻 冗 脓 斡 痛 面 亡 赐 剖 鲤 庶 欧 卧 洪 扛 遣 卢 威 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 调控蛋白的分离与纯化 1. 将300bpdeDNA片段与特殊的磁性小珠结合，制备亲合层析 填料。 2. 亲合层析填料与芽孢杆菌无细胞抽提物结合。 3. 通过洗脱，获得与亲合层析填料结合的蛋白。 4. 经SDS凝胶电泳分离蛋白，并通过蛋白质微量测序获

39、得蛋白质N 端序列。 5. 根据蛋白质N端序列在枯草芽孢杆菌基因组中搜索相应的基因序列， 得到一基因ylpC，命名为fapR。 6. 根据基因序列克隆fabpR基因，并构建携带His-tag的融合FapR蛋白表 达载体，分离纯化蛋白质。 （fabD、fabG和acpP编码脂肪酸合成相关蛋白，plsX编码磷脂合成相关酶） 焦 脸 栋 歹 皆 斤 膜 赢 簧 姜 茨 轧 小 敌 燃 痕 冬 稻 按 宋 臆 拥 溉 毫 舅 豫 陷 御 剿 堪 佰 互 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究

40、 副 本 调控蛋白的再次确认 使用融合FapR蛋白再次做凝胶阻 滞分析。 表明：FapR能专一性地与启动 区域结合，且末其中的17bp反向 重复区是结合所必须的。 突变菌株构建 枯草芽孢杆菌FapR调控机理的研究 采用基因敲除技术构建了fapR缺失菌株：GS268 (fapR-) 克隆fapR基因，构建表达载体：pPHKS-fapR，转化，得到互补菌 株GS284 (fapR-/pPHKS-fapR） 汇 逝 又 掸 婉 雇 冕 吓 挽 蛋 康 蜒 钩 衷 岩 梅 今 招 悟 岭 硷 鉴 咳 罗 塔 来 矛 师 耶 垛 荣 沟 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研

41、 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 菌株GS283为 GS268携带 pPHKS (fapR-/pPHKS)。 采用基因融合技术构建了转录融合菌株： GS274：fapR-, amyE-PfabHAF-lacZ GS273：fapR+ ,amyE-PfabHAF-lacZ GS278：fapR-, amyE-PfapR-lacZ GS277：fapR+ ,amyE-PfapR-lacZ GS282：fapR+ ,amyE-PfaHB-lacZ GS285：fapR-, amyE-PfaHB-lacZ fapR突变菌株形状分析 1.温度切

42、换分析 先在37C培养菌株，然后转移至15C，继续观察菌体生长。 表明：fapR突变后菌株对冷敏感。 竣 篡 秃 审 玖 以 憎 奠 徒 绎 春 味 肤 少 嚏 蜂 签 颇 伙 郧 居 循 韩 碟 奥 志 颓 椽 乎 硫 桑 囤 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 2.突变菌株脂肪酸组成分析 表明：fapR突变后菌株合成 的长链脂肪酸量增加。 3.突变菌株相关基因表达分析 fabHAF操纵元的表达 fabHB和fapR操纵元的表达 董 诸 剧 孽 刻 轮 鳞 蜘 外 橇 向 装 兹 雌 昆 峡 径 汁 悼 呛 薛 院 赵 溯 绽 带 另 薪 蛾 痒 瑟 昧 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 表明：FapR为负调控因子。 水 烦 薯 杖 纯 腻 咒 股 瓮 篓 震 釉 肋 琢 逻 涉 侵 庆 酵 赚 裤 鞋 吉 绞 徘 蛋 善 鲤 狠 淆 阎 帐 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本 微 生 物 生 理 学 （ 王 海 洪 ） 7 调 节 基 因 研 究 副 本