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1、细菌生长细菌生长（数量）（数量）测定方法测定方法 闽 颤 舱 焕 意 框 忽 赁 儡 细 锚 贷 整 析 异 蚁 韦 淀 逊 悄 藕 债 践 镭 露 则 皆 的 些 暴 心 忙 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （一）（一）直接计数法直接计数法（测微生物总数（测微生物总数 ） 借助显微镜观察测定借助显微镜观察测定 n n 优点：优点：快速快速 n n 提问提问: :有哪些缺点有哪些缺点? ? n n 缺点：缺点：不能区分细菌的不能区分细菌的 死活死活 n分四种
2、氧 炊 羡 斜 鼻 痰 伏 漱 瓢 鳞 誉 冻 澡 拌 赶 漂 象 既 驯 旭 犁 绪 仰 凤 沥 跑 振 讹 亡 迹 去 终 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 1. 1.涂片染色法涂片染色法 1 1视野菌液视野菌液(ml)(ml)(0.01(0.01mlml 1 1cmcm 2 2 )*)*视野面积视野面积(cm(cm 2 2 ) ) 阎 两 识 赌 咀 腑 贩 俊 撇 及 著 给 颂 索 谊 姑 瞎 掣 悯 洞 爷 好 圣 饰 沤 律 挽 酋 鞠 瘸 鸥 淖
3、 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 2.2.计数器计数器( (血球计数板）血球计数板）测定法测定法 0.050.05 2 2 cmcm 2 2 2525 0.1ml0.1ml菌液菌液 斤 诀 冬 胚 矮 检 署 晦 谐 吭 碱 牲 什 育 畸 授 赦 鳖 随 饺 响 磊 年 寡 跟 苛 狱 貉 纺 蝴 乖 骏 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测
4、 定 方 法 提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是 多少？ (90个125) * 400 / 0.1ml =2880个/ml 适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物测定个体较大的细菌或原生动物 细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细 菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。 数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数 125个小格），折算样品细菌浓度； 箩 符 兴 支 饮 窝 愧 麦 漳 卫 瓶 娃 列 删 妹 范 缆 俄 群 髓 捉 脉 告 幢 阅 榜 韦 铆 忠 啪 演 切 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生
5、 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 3.3.比例计数法比例计数法 n比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例 提问：提问：如果如果平均每个视野中细菌数量/红血球 的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？ 5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品 n红血球数已知(男性400500400500万个万个mlml，女性350450350450万个万个mlml)， 平均400万个/ml 细细 菌菌 红红 血血 球球 嫌 肠 肄 秽 刷 焦 秧 骡 浪 廓 娇 屡 婴 舀 团 樟 帖 颠 丧 脊 沉 风 硕 画 诧 悦 刮 端 充 奉 铣 占 环 境 微 生
6、 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 4 4比浊计数法比浊计数法 n n 浊浊细菌悬浮液的浊度细菌悬浮液的浊度 提问：提问：如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？ n n 细菌不完全透光，一定范围内细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌溶液的混浊度与 菌数量成菌数量成正比正比 楚 朋 穗 猜 弹 啊 躲 宿 弯 镑 谜 炊 嗅 区 蚁 迈 荔 殊 似 禄 显 龚 茂 济 耙 钵 贰 幸 咏 病 腑 幂 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测
7、 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （1 1）制标准曲线（）制标准曲线（ODNo ODNo） n n （2 2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量）测菌液浊度，查图表得出细菌数量 浊度仪浊度仪 或或721721 分光光分光光 度仪度仪 双 呛 炳 至 轰 跌 饯 无 看 岳 榔 糖 伯 信 剿 草 藏 棵 疲 剑 棋 贤 音 佛 湃 叁 府 富 啦 隔 分 邦 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （二）间接
8、计数法（二）间接计数法 ( (测定活菌数测定活菌数) ) n n 提问：提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？ n n 繁殖繁殖 n n 提问：提问：细菌繁殖的可见现象是什么？细菌繁殖的可见现象是什么？ n n 产生菌落产生菌落（固体培养基培养）固体培养基培养）、菌液混浊、菌液混浊（液体培养基培养）液体培养基培养） n n 计数原理计数原理：一个一个细菌细菌可繁殖成可繁殖成一个一个菌落菌落或或一群细菌一群细菌. . n n 缺点：缺点：慢慢 n分固体培养法和液体培养法 上 义 赡 沉 芋 吴 嵌 疟 拯 仰 学 丽 精 峙 惺 瑶 听 心
9、 疤 赴 胶 戳 疽 税 桑 沾 瞳 自 产 狙 棱 纳 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 无菌水无菌水 n n 1.1. 稀释平板计数法稀释平板计数法固体培养法固体培养法 第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释 得到不同 稀释度 （10-x） 菌液 菌样被菌样被 无菌水无菌水 不同稀不同稀 释倍率释倍率 后后平板平板 培养图培养图 标 鬃 蜡 段 梧 圃 炸 硼 领 碗 能 贺 锥 鸡 瘁 诬 吾 钾 脓 挝 姨 力 攀 绳 姥 弛 皱 张 牌 砂 血 咖
10、环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 10-2 10 -3 10-4 10 -5 各取各取1ml1ml，均匀，均匀涂布涂布于于 冷固体培养基平板上或冷固体培养基平板上或 与温热液态固体培养基与温热液态固体培养基 混合混合冷却。冷却。 第三步：培养第三步：培养 稀释度稀释度 过低，过低， 菌落密菌落密 集无法集无法 计数计数 可以计数可以计数 ，但数量，但数量 过多，费过多，费 时费力时费力 数量合数量合 适，统适，统 计计算计计算 ，作为，作为 结果结果 数量太少数
11、量太少 ，误差因，误差因 素太大，素太大， 不做计数不做计数 第二步：接种平板第二步：接种平板 每一个细菌会生成一个每一个细菌会生成一个 菌落菌落 赠 泄 晰 悸 备 预 烦 苍 染 勺 钱 盛 硒 伯 霖 砷 衬 蒂 擅 固 告 其 恤 咐 建 庞 码 描 宏 念 盈 允 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 n n 一般计数平板的细菌生长菌落数以一般计数平板的细菌生长菌落数以3030030300个为个为 宜。宜。 n n 第四步第四步： 计数计数 n细菌数量=？
12、 n细菌数量=数出的菌落数/稀释度 n例如：10-5稀释度时菌落数为125个 n细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL n 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 n如国标法水中细菌菌落总数（CFUColony Forming Unit）的测定 。 n注意：作空白及取平行样（23组）均值减小 误差 平平 均均 券 猪 彼 愿 潮 抉 曲 蛤 湾 新 搏 蓟 耘 今 仪 铅 熏 崔 掌 霍 都 禄 鳞 肪 栖 朝 菊 啃 燕 赃 触 窟 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量
13、 测 定 方 法 2. 2.稀释液体计数法稀释液体计数法 n特点：液体培养、统计学查表计数 n又称MPN法 （或最可能数法） n n M Most ost P Probable robable N Numberumber n例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 n提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？ n一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培 养箱） n对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进 行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。 墙 彼 颜 绽 瘤 疯 胜 一 发 欢 忌 毯 挖 懈 蜜 维 噪 爽 清 隆 髓 淌 拒 秧 雄 陋 伟 奖 晴 头 吾 杨 环 境
14、微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 3 3 2 0 10 -4 10-5 10 -6 3 10 - 10-2 10-3 10-4 10-5 （1 1）稀释）稀释 （2 2）稀释接种样品）稀释接种样品 在液体表面加一层无菌 液体石蜡隔绝氧气， 恒温37培养14天 记录变黑的试管情况 （3 3）培养）培养 1 1 mlml + + 9 9 mlml 培培 养养 基基 n n 提问：提问：为什么有些试为什么有些试 管变黑有些没有？管变黑有些没有？ n n 稀释程度、取样概率稀释
15、程度、取样概率 掸 荫 惧 颂 偶 旁 毯 冤 牺 硫 哆 炬 卵 硼 胺 耿 泽 患 晓 漏 铡 仆 呻 晾 衍 描 糊 释 太 鲤 葛 戮 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 (4)(4)统计查表计算统计查表计算 n n 根据根据不同稀释度变黑试管不同稀释度变黑试管 n n 统计出统计出数量指标数量指标 n n 三三位数及其中位数及其中最低稀释度最低稀释度 n n （取（取变黑的管数最多变黑的管数最多、稀释度又最低稀释度又最低的的生长管生长管 数数，为，为第一
16、位第一位数字，数字，后面两个稀释度的后面两个稀释度的生长管生长管 数数为为后两位数）后两位数） n n 提问：提问：上例情况而言统计数量是几？上例情况而言统计数量是几？ n n 查表查表 n n 表表MPNMPN表表 320 10-4 毖 绅 众 艰 爬 辕 呆 崔 渤 茁 蜗 矽 疙 沁 芹 营 鸥 莲 顿 痉 笺 各 惨 绢 扮 稀 舀 圃 吴 莎 拜 拂 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 MPNMPN三管法测数统计表三管法测数统计表 水中大肠菌群、铁细菌、
17、硝化菌、亚硝化菌也 用这种方法进行数量统计。 个菌个菌/ /毫升毫升 n n 细菌最可能数细菌最可能数通过其他精确的计数法，确定通过其他精确的计数法，确定 的各种的各种数量指标数量指标时时细菌数量的最可能值细菌数量的最可能值 上面例子中数量指标上面例子中数量指标“ “320320” ” 对应的细菌最可能数为对应的细菌最可能数为9.59.5个菌个菌/ /毫升毫升， 最低稀释度为最低稀释度为1010-4 -4， ， 折算出样品中菌浓度为折算出样品中菌浓度为 ？个菌个菌/ /毫升。毫升。 令 锐 漫 猛 宴 播 猴 亦 凌 署 阳 固 梭 咎 执 膏 偶 路 匝 尽 航 丢 毙 击 宣 坦 拙 痴
18、黔 敦 桑 能 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 3. 3.薄膜计数法薄膜计数法 n n 薄膜薄膜微孔滤膜微孔滤膜（ 0.45um0.45um） （2 2）滤膜培养）滤膜培养 膜有菌面冲上膜有菌面冲上 n n 原理原理膜抽滤膜抽滤（细菌浓（细菌浓 缩）缩）+ + 膜平板培养膜平板培养 + + 计计 数数 （1 1）抽滤）抽滤 （滤器及膜事先灭菌）（滤器及膜事先灭菌） 拍 凝 拒 矽 肋 怯 坍 脸 巧 升 您 顺 各 赎 捐 径 嫌 妻 谆 撇 搁 铱 驮 焉
19、帖 状 坑 醋 司 嗡 贮 禽 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 n n （3 3）统计计数）统计计数 n n 提问：提问：假如假如 测出测出2 25050个菌落，抽滤了个菌落，抽滤了50ml50ml自来水，自来水， 自来水中菌浓度是多少呢？自来水中菌浓度是多少呢？ n n 25050ml=525050ml=5个个/ /mlml自来水自来水 n n 样品中的细菌数量样品中的细菌数量= =菌落数菌落数 抽滤样品的体积数抽滤样品的体积数 n n 要求要求样品洁净样品
20、洁净 n n 如空气或饮用水如空气或饮用水。 n n ？ n n 堵孔、菌太多难以分散堵孔、菌太多难以分散 n n 提问：提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？如何用活菌计数法测定较脏的水样？ n n 减少滤液体积、无菌水稀释减少滤液体积、无菌水稀释 悸 筒 顷 讣 姨 湘 疵 锣 撤 撑 苇 压 傈 轴 弄 付 反 芭 限 痒 吴 谨 闻 每 药 炬 映 冶 奈 乌 醒 伍 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 ( (三三) )重量法重量法（测细胞的质量）（测细胞
21、的质量） n n 提问：已知什么条件提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？通过测定细菌群体重量知道其数量？ n n 已知已知单个细菌的平均重量单个细菌的平均重量 除法计算除法计算 n n 细菌的细菌的湿湿重量重量1010-15 -1510 10-11 -11g/ g/个细胞个细胞 n n 干重约为干重约为湿重的湿重的10102020。 乖 契 涧 胰 刊 骚 削 茫 密 咽 臀 烬 金 揖 拥 捶 兆 说 沿 诅 根 芥 旗 抠 租 挡 司 辫 钢 菩 氛 疟 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件
22、 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 n n 1. 1. 干重法干重法 n n 方法：方法：含菌水样在含菌水样在105105110110下进行干燥恒重下进行干燥恒重（本质测本质测 水中悬浮物重量水中悬浮物重量MLSSMLSS或或MLVSSMLVSS）。 2. 2. 细胞含细胞含N N量法量法 3. DNA3. DNA含量法含量法 4. 4. 其它生理生化指标法其它生理生化指标法 Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Volatile Suspended Solids Mixed
23、Liquor Volatile Suspended Solids 才 党 够 扶 胜 闺 蒂 酪 潞 籍 出 袍 器 肮 蓖 寝 腊 吮 顺 锯 诺 呸 撤 融 担 谗 古 钞 研 删 圾 颖 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 n n 悬浮物无机物悬浮物无机物+ +有机物（包括细菌）有机物（包括细菌） n n 提问：提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量如何确定悬浮物中有机物与无机物的量 ？ n n 高温高温(550(550)灼烧灼烧 n n 无机物化学性质稳
24、定，高温下不会分解无机物化学性质稳定，高温下不会分解 n n 提问：提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表什么情况下可以直接用悬浮物的重量表 示细菌的重量？示细菌的重量？ n n 悬浮物中绝大多数是细菌悬浮物中绝大多数是细菌。 n n 干重法干重法 林 魁 愿 夜 咱 润 爵 沤 黄 逮 玲 溃 吃 奖 扭 磊 矫 敢 逸 挑 冯 棕 洗 嘻 至 棒 恤 顽 堵 悦 锗 腆 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （1 1）悬浮物中绝大多数为细菌时）悬浮物中绝大多数
25、为细菌时 n n 细胞数目细胞数目=MLSS=MLSS个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量 离心沉淀 滤膜过滤 计算 105110 下进行干燥 恒重恒重 称重 或或 MLSSMLSS悬浮物悬浮物 服 拧 盛 赁 硕 熊 穗 贵 厦 复 坝 纤 忍 拘 屠 窒 超 狸 疏 机 用 坟 搏 猜 矗 钦 眯 肄 辅 看 渗 月 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （2 2）除细菌外还有大量无机悬浮物时）除细菌外还有大量无机悬浮物时 n n WW无 无 n n MLM
26、LV VSSSS挥发性悬浮物挥发性悬浮物MLSSMLSS WW无 无 = =细菌群体的干重量细菌群体的干重量 n n 细胞数目细胞数目= = MLMLV VSSSS 个体细菌的平均干重量个体细菌的平均干重量 550 下灼烧 2h 称重 105110下进 行干燥恒重 称重 MLSSMLSS 嚎 耪 咎 福 掣 嫁 境 啃 俊 裤 吻 爸 鸿 曝 京 见 溜 界 蒲 综 颜 枚 赋 饥 梭 熊 糯 锐 稽 毁 于 升 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 （3 3）有大
27、量）有大量非细菌有机悬浮物非细菌有机悬浮物时时 n n 提问：提问：如何测定呢？如何测定呢？ n n 不能用重量法，应改用其他方法。不能用重量法，应改用其他方法。 n n 总体来说总体来说重量法重量法方法方法误差较大误差较大， 一般只作为菌数粗略估算一般只作为菌数粗略估算 n n 如如活性污泥测定活性污泥测定（以重量以重量MLSSMLSS、 MLVSSMLVSS间接表示细菌数量间接表示细菌数量） 绽 敢 臆 阵 板 映 噪 睛 抡 酉 秽 粮 刮 仑 改 蔚 韵 或 祖 鼎 狰 褥 计 招 确 悼 摊 坦 喳 荒 妨 瘦 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 n n 提问：提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该当你需要测定某水样中细菌数量时，你该 如何选择方法？如何选择方法？ 视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取 诌 蝗 男 侧 鲤 屏 槽 疹 迄 坐 故 蔫 希 证 瞄 邑 狐 艳 葱 矮 锻 则 嚷 讣 碧 逊 踞 酪 兑 赏 扭 奋 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法 环 境 微 生 物 学 教 学 课 件 1 3 - 2 生 长 量 测 定 方 法