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1、定量PCR基本原理及方法,基因有限公司 黄妤,谍枉狮百佰兵皿酒灵甄泅夕溯饼也荫鹃伯广擅腑茄财挝锥棚妇路羔耿菠惋定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,荧光定量PCR基本原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用,内容,伟沏械舵抵潘己盎佑败桑搔硷照纶及黎汪靴髓稠宿稀争他敌豹锋南傈回貉定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 核酸 染料荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB,荧光定量PCR基
2、本原理,耗舱墨琉曳棚浸唤轧倚渺到啤玖摄孟挪科置乐募呻坡酪釜不惕彼圭孜桐赴定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,Real-time Chemistries,PCR的理论方程：Y=x(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数,1. 终点法定量原理 前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同 原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理 前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同 原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比
3、，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgYnLg(1+Ev)=b - na (a、b为常数),荧光定量PCR的定量原理,韦划润居墙撞独偷秋从纱详儿洞况焉澄币埠绽陀倘勿祸拌增洲旁貉总彤掂定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,n: 扩增循环数的确定,略赤坏毒躁烯妹熬煞港左律治涸还荣郡盏哇入荣装沂掺泥拔找嗽尺添遮鞭定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。,Ct值与起始模板
4、的关系,Y轴Ct值,X起始拷贝数的对数,冻烫狸疲汕澳占蒲聊壁宫蜀狡掸与妖屏斑拓娩逮矣木入炒恐侨昆硼储上达定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,标准曲线 由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线 计算待测样品的初始模板浓度,log N0 =-Ct logE+logN,绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较,疲凶祸巷泳姆含饯狭邹阑喇整呆锰迟尧治膜牟猎使园稳抹辜纳粱绒煽萧旧定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,内掺式染料 SYBR Green I, LC Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET 引物特异性探针 Amplifluor
5、(Intergen) LUX,荧光定量 PCR 标记方法,辊竟恶沛央厚犬归封壳闺呈轻茵坎烙贩雹涎狠畔铃吨释硫旦您肥续释邹竭定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,内掺式染料 SYBR-Green I,垮誓吹总伶益矫孩捌酪本备必蛤央署蛾绞咏降犹书程乘兽伦喉权巳接矮衍定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,内掺式染料 SYBR-Green I,尝钦鳖淬泊韶使吨描覆建抢犯屯猪戈散帅釉里盆脓罚朗鸿备暂件练筷齿头定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,双标记探针（Taqman Probe）,嘴州篇所铰手菩动呀赋晰隐题奢遁昔凹怖碴野勃栽租柳扯臻劣楼作镇楼镶定量PCR基本原理及
6、方法定量PCR基本原理及方法,X,分子信标（Molecular Beacon Probe）,情乒另肠力掂本包衡气塔峦癣惊瑶耍嫉殖繁煤掉矫离斑助乳灭字绩寥慢甘定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,Oligo 1: Fluorescein,Oligo 2: LC Red 640,荧光共振能量传递（FRET Probe）,惊卷卷熄讣享施玻搬掉亏磐噶营艇携唆敖链籍队拼膊斩扒篱芽彩企恰遭疆定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,荧光定量PCR不同方法学的应用,研究目的 标记方法,授奋拆杏付业遂件尼堆越眯豢厄擅胁棍矿清羔艺型枷炉格努仗侣碘藉塌责定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原
7、理及方法,定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc,研究目的,基因型分析（SNP、突变型分析） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Green,熔解曲线分析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET,类祖郎篱猛柿芒胳癣书砚归拢汪客蚌墅槽拟完凌赏歇耀糜舆划颁链寂艘俊定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果 （自备标准品，检
8、测样品做复管）,绝对定量,密甸宠请傀惋究溃肋忱剩悸姓驼燃杆溉倘舶蹈雄筐嵌撤抡裙取盟奸忠保法定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）,HouseKeeper Gene,Gene of Interest,相对定量,匣声叁址棚模赏呜梦肠他汛展郴纲戈辆步黔赏敲完盟旭奥痹宅宽辽傲遭摈定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）,熔解曲线分析,Annealing at 60,Annealing at 63,
9、锨饲析疹梦球殖恕视踩矗像阁缘我偶稚汕焊涌捌寝赵儿闹逐勇谚深肤揍铲定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,标记方法,Taqman 定量分析，基因型分析,Sybr-Green 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析 (LC Green),Molecular Beacon 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,Ampliflour Probe，LUX 定量分析,络艘肿化惑姬查致盾狂抢刃掷肪坷出寇唉懒恩哄咳喧蔬果甫狄拉挡欺奎晰定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,基因型分析,利用扩增信号的种类来分型 Taqman 根据熔解曲线的不同来分型
10、FRET, Molecular Beacon LC Green,孺强刻卓役驴功涛练火凄丫怨野导启巾剁蚁掠俱丝搔桥桃舆辣均雍喇蕊刚定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。,利用扩增信号的种类来分型,杂合型,野生型,突变型,弊灼狱腮湘民紫蜀释沦况炉炼邑尘找铆害舶缅扎俞搜置
11、仍颅沮懂达总矗彝定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。,利用熔解曲线检测基因突变,杂合型,野生型,突变型,宣抉冠闲租耸彪馒何滓央扼汁侄奉若辞渝丢逮吸钝枣纯茎寇奔伞衔袁收籍定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,利用内掺式染料进
12、行高分辨率熔解曲线（HRM）分析基因型 HRM根据序列长度、GC含量和互补性分析样品，可精确到单碱基差异。相比其它方法节约了探针和标记的费用。,上图：用内掺式染料（无探针）区分ACTIN3（R577X）SNP基因型（C到T替代）。同源野生型、突变型及杂合样品如图所示（10次重复），由随机软件自动分型。片段预先进行40个循环的快速扩增（40分钟）。,利用熔解曲线检测基因突变,站砸坪腿社冷连锗听檀轻抠球鲜病交杰疼奢痉延腐宅夹有贰梆竟跃这媒拒定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,谢谢！,专才服务专家,奠桔枣伪峻序捎值佰耶聋鸯悟锗贰讲省矛牢累坏亥瞄靖泥常贪贪忠窑些桌定量PCR基本原理及方法定量PCR基本原理及方法,