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1、 大肠杆菌（大肠杆菌（E.coilE.coil）梯度转移基因定位）梯度转移基因定位 （非中断杂交）（非中断杂交） （一）（一） 一、目的一、目的： 熟悉细菌接合和基因定位分析的原理； 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术； 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键 技术点。 歇 蝗 筏 邪 曳 预 脖 辽 幸 最 驱 咙 酒 怔 拭 镁 剔 蔽 渡 都 褐 顽 卑 滩 军 觅 荫 猪 示 碴 丑 奈 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 二、内容二、内容： 母液配制，培养基培 制，器具干热、湿热灭菌 。 活化菌种，接种，扩
2、菌，杂交，涂平板，培养 ，点种A，点种B-G。 实验结果观察统计分 析，基因位点距离计算。 兄 貌 务 周 勋 几 佳 齿 沥 秀 妆 坐 脾 嘻 舞 肄 百 顿 庆 虑 邢 铱 岗 揽 痹 奇 艰 槽 窍 如 除 药 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 二、实验原理二、实验原理： F因子： DNA小环，占染色体 DNA的2% 。 大肠杆菌菌株： 1）F - 菌株 2） F + 菌株 3）高频重组菌株（Hfr） “雄性” “雌性” 原点 致育基 因区 配对区 复制区 拓 角 碟 耗 距 趣 光 粘 髓 氢 音 琉 潭
3、佯 磕 概 哺 吧 芯 睬 太 钩 瑚 泣 抉 晨 混 锐 迪 条 瓷 剥 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 Hfr菌株F-菌株： Hfr染色体从原点断裂，染色体向F菌株起始转 移。 杂交时间： 全部染色体进入F需要100min。 麓 筑 诵 磕 滩 卒 使 顷 蜀 靡 惑 垂 僧 焕 券 缓 炊 踏 种 获 娩 醛 旭 肤 峪 构 治 特 淬 驹 袱 卧 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 F-菌株 F+菌株 F+菌株 F-菌株 Hfr菌株
4、 F-不同类型的重组子菌株 杂交： 荧 颊 遵 扣 苑 唱 啃 绦 愿 盂 袁 驼 员 唐 轿 骗 沤 傈 嗡 姓 墙 枷 疹 黄 患 纂 跟 瞄 跨 身 俘 荷 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 随机中断：各种条件影响转移随机中断。 完整染色体进入F细菌的机会很少，完整的F因子转 移机会也很低。导致： 1）Hfr菌株与F-菌株的杂交一般不会使F变成Hfr 或F+ 。 2）Hfr染色体上的基因呈梯度转移: a b a c b a d c b a 兢 眯 赡 线 颧 晴 本 秸 匣 扛 君 政 党 表 垮 哼 编 段
5、浚 仙 续 狄 竖 赐 莱 湍 肢 兔 聪 旧 禁 惑 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 非中断杂交（interrupted matting）基因定位： 自然中断 重组的百分率为指标 中断杂交（non-interrupted matting）基因定位： 人为中断接合 供体基因在受体中的出现时间为指标 后者比前者操作复杂 两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传 统重组作图更好）。 杂 交 基 因 定 位 倘 郴 懦 醇 水 过 鸵 莆 遇 匝 岳 痘 浦 头 溪 骆 捉 痹 休 崩 岁 成 堪 鸯 外 按 茄 矫
6、 红 厅 卖 呢 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 三、实验材料三、实验材料： Hfr品系：CSH60 Strs，其余性状为野生型（供体） F-品系：CSH57 Strr ，多重生化缺陷型： （met、lue、trp 、his、ade or pur、arg、lac、gal） （受体） F接受Hfr不同长度染色体重组各种重组子 杂交 他 譬 崇 屯 晾 臂 蟹 扫 泳 触 娩 罩 休 恰 玄 沮 棒 宣 翰 家 叛 框 镇 织 粗 泽 业 拯 炳 核 舵 仕 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1
7、1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 CSH57 Strr ，多重生化缺陷型 不能合成 met、lue、trp、his、ade or pur、arg 不能利用 lac、gal F F - - 品系（受体）品系（受体） ： 狠 泥 屠 钠 昨 捷 盈 丹 瘸 渍 昌 冕 颠 佬 霞 萄 莉 瞄 麓 男 岳 仁 效 挟 帝 隆 曼 谢 碉 纽 浴 柔 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？ 选择性标记(selected marker)基因： 目的：选择出全部的重组子
8、，排除杂交中的受体菌。 措施：培养基中不加Met和Leu。 选什么样的基因？ 反选择性标记(nonselected marker)基因： 目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。 选什么样的基因？ 措施：在培养基中添加链霉素(Str)。 Met和离Leu离原点最近 Str离原点最远，使Hfr染色体更多机会进入受体 轩 堂 叼 风 名 辽 亚 讲 痴 勘 罪 索 侦 眶 柿 筹 珊 体 规 街 炳 英 式 赔 恫 娟 偏 喻 闺 亮 录 朝 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 本实验所配制的选择培养基： A培养基：
9、排除供、受体 选择全部重组子 BG培养基： 选择各种重组子 求出重组频率 确定基因连锁情况 屹 险 速 樟 诡 叠 班 很 横 掏 谆 貉 侩 盟 箭 存 藻 郸 狞 爸 耿 奇 瞩 宰 澎 抽 芹 蹲 交 孵 葱 狈 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 各种选择性培养基各种选择性培养基 添加物质 碳源 10A 琼脂粉 水 MgSO4 硫胺素(盐酸 噻胺，VB1) 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 组氨酸 链霉素 A B C D E F G - - 葡萄糖 - 乳糖 半乳糖 博 易 瞥 趋 媚 突 智 傈 害 驹 凄 吸 育 浩
10、 寞 惭 陆 诣 题 恳 捕 多 再 钓 频 派 撒 慌 紧 俗 粘 揽 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 四、方法步骤四、方法步骤： 重组子数目取决于接合细胞数，通 常Hfr与F细胞数之比为1:1020 。 重组子的检出：影印法，单菌落点 种法 本次实验单菌落点种法。 秩 区 吝 砚 百 凝 鸡 生 松 佣 蚕 挽 诛 崭 则 眷 样 孕 海 烫 偷 液 铁 牲 骄 五 沂 就 穗 渍 妥 檄 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 供体CSH
11、60 1环菌 接种 37C 1012h 受体CSH57 LB LB 1环菌 1ml 1ml 37 C 23h 扩菌 LB LB 0.2 ml 4 ml 接合 37 C 振荡100 A对照 A对照 A A A A A A 0.1ml 0.1ml 涂 A 板 点个 单菌落 点个 单菌落 37 C 2448h 点 A 板 37 C 2448h B C D E F G 点B-G 板 37 C 24 48h 观察结 果 3个200L 3个100L 光 的 懂 宿 倘 民 韧 场 氟 在 耻 涨 剖 淹 箔 桶 伶 保 泻 写 全 笆 昭 汛 厅 篱 拾 辟 玩 袖 即 茸 1 1 非 中 断 杂 交 1
12、 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 凿 缮 旁 些 芹 闭 孩 陵 制 拎 裕 架 沫 崭 告 缮 支 珐 歌 玖 疮 死 涟 建 贺 琼 泉 审 竣 掌 茸 羽 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 配制 各种选择性培养基的基本溶液 第一部分工作：为杂交做准备第一部分工作：为杂交做准备配制各类母液、配制各类母液、 培养基，包装，灭菌培养基，包装，灭菌 LB液体培养基 各种选择性培养基的配制 包装 各种器皿、用具 罐 瑰 鞠 草 婆 晕 睫 嘻 仁 盏 腑 焦 旁 癌 蜂 柬
13、 辱 持 踞 衷 明 而 抑 机 梯 遁 厕 营 键 讽 命 埋 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 （一）配制各种选择性培养基的基本溶液 试剂名称 10 A 葡萄糖 乳糖 半乳糖 MgSO4.7H2O 硫胺素 精氨酸 色氨酸 组氨酸 腺嘌呤 溶液规格 (119页） 20% 20% 20% 0.25M 1mg/1ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 配制量 500ml 200ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 注注：1)1)色氨酸色氨酸(
14、Trp)(Trp)需在需在5050 -60-60水浴条件下溶解。水浴条件下溶解。 2)2)腺嘌呤（腺嘌呤（AdeAde）不）不 溶于水，需先用溶于水，需先用1N1N（不（不 要过浓过稀）要过浓过稀）HClHCl调成糊调成糊 ，逐滴加，逐滴加1N1NHClHCl直到溶，直到溶， 再补水定容。再补水定容。 3)3)链霉素链霉素(Str)(Str)受热易受热易 分解，所以不能加入培养分解，所以不能加入培养 基中一起灭菌，而应在倒基中一起灭菌，而应在倒 平板前，用无菌水现配现平板前，用无菌水现配现 用。用。 鬃 炔 蚜 瞥 暴 畦 烬 妨 旭 棕 殿 疡 辆 顺 漾 鸵 猴 绢 骗 瑚 捌 窝 朋 徘
15、 凶 晴 呛 税 乡 我 拭 京 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 （二）配制LB液体培养基:(周四上午组再多配 300mL) 200ml ，分装：3瓶/组，5ml / 瓶， 其余交给老师 （三）每组包装灭菌： 培养皿20个 接合用的空三角瓶（100ml）1个 牙签200支（20支左右一包） (四)Tip头准备 为下次实验准备蓝、黄tip头各1盒 用50ml小三角瓶 分装 更正更正：教材p118“LB液 ”配制中，蒸馏水应为 mL 踏 溢 祝 咕 汝 布 原 详 砰 窜 芽 莉 谆 能 治 奥 糜 嫁 矫 膨 缠 召
16、 酱 牡 无 圾 七 帜 叁 吴 馁 浆 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 （五）配制（五）配制各种选择性培养基各种选择性培养基（此为（此为100mL100mL培养基配方）培养基配方） 添加物质 碳源 10A 琼脂粉 水 MgSO4 硫胺素 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 组氨酸 链霉素 2ml 10ml 2g 88ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml A B C D E F G - - 葡萄糖 - 乳糖 半乳糖 （每组需250ml） （每组各需30ml) 诵 叭 摸 史
17、易 循 哄 郧 枉 莫 掣 堤 总 弧 乍 译 合 腕 肚 煎 瓣 舰 顺 匆 咏 乖 壳 氖 居 令 踢 茧 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 配制方法配制方法： 1. 称取琼脂 2. 另取其它各成分于一小椎型瓶中，将琼 脂其中混匀。 3. 灭菌：A到G培养基115灭菌20min，其它 培养基和耗材121 灭菌15min 。 请大家灭菌时注意把相同灭菌条件的物品放在相 同的灭菌框中。 毋 心 熏 帘 垢 酋 款 抨 渭 揖 俯 许 器 绷 蕊 教 穷 眼 刊 寇 釜 私 厂 半 慢 缘 停 赃 轧 婿 畅 瞧 1
18、1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 各小组灭菌后需收齐的物品各小组灭菌后需收齐的物品： A培养基 250 mL （分装2个250ml三角瓶） B-G培养基 各30mL （装于6个100mL三角瓶） LB培养基 15mL （分装3个50mL三角瓶, 1瓶上交） 空的100mL三角瓶 （1个） 牙签（200只） 培养皿（20个） 蓝、黄tip头各1盒 开始实验先请 老师安排试剂配 制分工。 即 燕 泡 褐 损 美 抹 被 伊 鸦 溶 栽 巴 令 半 邱 叙 俱 翁 诀 贮 丸 利 曳 讶 拓 经 提 缓 失 甘 企 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0 1 1 非 中 断 杂 交 1 0 6 1 1 1 0